Direct RNA sequencing - barcoding (SQK-DRB004.24) (DRB_9230_v4_revA_26May2026)
MinION: Protocol
Direct RNA sequencing - barcoding (SQK-DRB004.24) V DRB_9230_v4_revA_26May2026
This protocol:
- Is for multiplex sequencing of native RNA
- Can be used with enriched poly(A)+ enriched RNA samples or poly(A)-tailed IVT transcript samples as your starting input material
- Requires no fragmentation
- Is optimised for multiplexing 4–8 poly(A)+ enriched RNA samples, or 12-24 poly(A)-tailed IVT transcript samples.
- Takes approximately ~360 minutes for library preparation
- Is only compatible with RNA flow cells
For Research Use Only
FOR RESEARCH USE ONLY.
Contents
Introducción
Preparación de la biblioteca
- 3. Preparación de la biblioteca
- 4. Preparación de la biblioteca
- 5. Preparación de la biblioteca
- 6. Preparación de la biblioteca
- 7. Acondicionar y cargar la celda de flujo MinION/GridION
Secuenciación y análisis de datos (1)
Descripción general
This protocol:
- Is for multiplex sequencing of native RNA
- Can be used with enriched poly(A)+ enriched RNA samples or poly(A)-tailed IVT transcript samples as your starting input material
- Requires no fragmentation
- Is optimised for multiplexing 4–8 poly(A)+ enriched RNA samples, or 12-24 poly(A)-tailed IVT transcript samples.
- Takes approximately ~360 minutes for library preparation
- Is only compatible with RNA flow cells
For Research Use Only
1. Aspectos generales
Utilice siempre la versión más reciente del protocolo.
MinKNOW 26.01 has updated RNA strand classification rules, resulting in improved sequencing performance and more accurate reporting in the MinKNOW UI and sequencing run reports.
What is changing?
In older versions of MinKNOW (25.09 or earlier), blocked pores - particularly common in "blocky" samples - could be misclassified as active strands, resulting in:
- Reduced Q-scores over the course of a run.
- Pore scans incorrectly reporting high pore occupancy later in the sequencing run.
- Blocked pores not being efficiently ejected, limiting sequencing output.
The release of MinKNOW 26.01 corrects this behaviour by accurately classifying blocked pores.
How does this impact me?
- Pore scans will more accurately reflect true pore availability.
- Blocked pores will be ejected more effectively.
- Sequencing performance may improve in some runs.
The improvements listed above will impact all sequencing runs, but will be especially noticeable on "blocky" samples. Users sequencing "non-blocky" samples will likely notice minimal or no noticeable change.
Please note: you may observe a decrease in the reported pore occupancy in the MinKNOW UI and MinKNOW reports. We emphasise that this is a measurement correction, with no performance regression.
Additional information for the MinKNOW 26.01 update can be found in the release notes:
Utilice siempre la versión más reciente del protocolo.
Características del kit Direct RNA Sequencing Kit
Este kit se recomienda sobre todo a usuarios que:
- Estén explorando características del ARN como bases modificadas.
- Quieren eliminar sesgos creados por la retrotranscriptasa o la PCR.
- Tienen transcritos que son difíciles de retrotranscribir.
Introducción al protocolo de secuenciación directa de ARN
Este protocolo describe cómo llevar a cabo la secuenciación de una muestra de ARN utilizando el kit de secuenciación Direct RNA Sequencing Kit (SQK-RNA004). A partir de ARN con un apéndice de poli(A) o de ARN total, se sintentiza una segunda cadena de ADNc para ganar estabilidad mediante retrotranscripción. Entonces, se ligan los adaptadores de secuenciación al híbrido ADNc-ARN para secuenciar en celdas de flujo para ARN MinION o PromethION (FLO- MIN004RA / FLO-PRO004RA respectivamente). Nótese, la cadena complementaria de ADNc no se secuencia, pero mejora el resultado de la secuenciación del ARN.
Antes de empezar, se recomienda hacer un experimento de control con RNA Control Strand (RCS) para familiarizarse con la tecnología.
Pasos del proceso de secuenciación:
Preparación del experimento
Pasos:
- Extraer el ARN, evaluar su longitud, cantidad y pureza. Los controles de calidad realizados durante el protocolo son esenciales para garantizar el éxito del experimento.
- Tener a disposición el kit de secuenciación, el instrumental adecuado y los reactivos de otros fabricantes.
- Descargar el programa para obtener y analizar los datos
- Verificar que la(s) celda(s) de flujo tiene(n) suficientes poros para realizar una buena secuenciación.
Preparación de la biblioteca
La tabla siguiente es un resumen de los pasos necesarios en la preparación de la biblioteca.
| Preparación de la biblioteca | Proceso | Tiempo | Parada opcional |
|---|---|---|---|
| Retrotranscripción | Sintetizar la cadena complementaria de ARN | 85 minutos ~ | En esta fase, el ARN retrotranscrito se puede guardar a -80 °C para utilizarse posteriormente. Nótese, esta es la única pausa de este protocolo. |
| Ligación del adaptador y lavado | Ligar los adaptadores de secuenciación a los extremos del híbrido ARN-ADNc | 45 minutos | Recomendamos secuenciar la biblioteca tan pronto como se liguen los adaptadores. |
| Acondicionar la celda de flujo y cargar la biblioteca | Acondicionar la celda de flujo y cargar la biblioteca | 10 minutos |
Secuenciación y análisis
Pasos:
- Empezar a secuenciar con el programa MinKNOW, que obtendrá datos brutos del dispositivo e identificará las bases.
Características del kit Direct RNA Sequencing Kit
Este kit se recomienda sobre todo a usuarios que:
- Estén explorando características del ARN como bases modificadas.
- Quieren eliminar sesgos creados por la retrotranscriptasa o la PCR.
- Tienen transcritos que son difíciles de retrotranscribir.
A diferencia del ADN, el ARN se transloca a través del nanoporo en dirección 3'-5'. Sin embargo, los algoritmos de identificación de bases invierten los datos automáticamente y las lecturas se muestran en dirección 5'-3'.
Compatibilidad del protocolo
Este protocolo debería usarse solo en combinación con los siguientes productos:
- Direct RNA Sequencing Kit (SQK-RNA004)
- MinION RNA Flow Cell (FLO-MIN004RA)
- Flow Cell Wash Kit (EXP-WSH004) - Este kit es adecuado para retirar la biblioteca entre lavados, pero no eliminará el bloqueo de los nanoporos relacionado con el ARN.
- MinION™ Mk1D - MinION Mk1D IT requirements
- GridION - Requisitos informáticos GridION
2. Material y consumibles
Material
- Direct RNA Barcoding Kit 24 (SQK-DRB004.24)
- 450 fmol of poly(A)+ enriched RNA sample(s), or 450 fmol of poly(A)-tailed IVT transcript RNA sample(s)
Consumibles
- Celdas de flujo ARN MinION/GridION (FLO-MIN004RA) o celdas de flujo ARN PromethION (FLO-PRO004RA)
- T3 DNA Ligase (NEB, M0317)
- Induro® Reverse Transcriptase y 5 Induro® RT Reaction Buffer (NEB, M0681)
- Inhibidor de RNasa murino (NEB, M0314)
- USER (Uracil-Specific Excision Reagent) Enzyme (NEB, cat # M5505L)
- Agencourt RNAClean XP beads (Beckman Coulter®, A63987)
- 10 mM dNTP solution (e.g. NEB N0447)
- 5M NaCl, RNase-free (ThermoFisher, 10609823 or equivalent)
- NEBNext High Input Poly(A) mRNA Isolation Module (NEB, E3370)
- Agua sin nucleasas (p.ej. Thermo Scientific, AM9937)
- Qubit RNA HS Assay Kit (ThermoFisher, Q32852)
- Kit Qubit dsDNA HS (ThermoFisher, Q32851)
- Tubos Qubit™ Assay (Invitrogen, Q32856)
- 0.2 ml thin-walled PCR tubes or 0.2 ml 96-well PCR plate
- Tubos Eppendorf DNA LoBind de 1,5 ml
- PCR plate seals
Instrumental
- Dispositivos MinION, GridION o PromethION
- Pantalla protectora celdas de flujo MinION/GridION o pantalla protectora celdas de flujo PromethION
- Mezclador vórtex
- Microcentrífuga
- Hula mixer (mezclador de rotación suave)
- Gradilla magnética, adecuada para tubos Eppendorf de 1,5 ml
- Centrifugadora Eppendorf 5424 (o equivalente)
- Cubeta con hielo
- Temporizador
- Termociclador
- Fluorímetro Qubit™ (o equivalente para el control de calidad)
- Pipeta y puntas P1000
- Pipeta y puntas P200
- Pipeta y puntas P100
- Pipeta y puntas P20
- Pipeta y puntas P10
- Pipeta y puntas P2
En este protocolo necesitará 300 ng de ARN con apéndice de poli(A) o 1 µg de ARN total en 8 µl.
Es posible empezar el protocolo con una cantidad de muestra reducida, aunque tal vez se obtenga un resultado inferior.
Consulte los siguientes gráficos de valoración de muestra inicial a modo de orientación:
ARN con apéndice de poli(A)
ARN total
Muestra inicial de ARN
Es importante que la muestra inicial de ARN posea la cantidad y calidad requerida. Usar demasiado ARN, poco o de mala calidad (p. ej., que esté muy fragmentado o que contenga contaminantes químicos), puede afectar a la preparación de la biblioteca.
Para más información sobre cómo utilizar ARN como muestra inicial, consulte los enlaces a continuación.
- Polyadenylation of non-poly(A) transcripts using E. coli poly(A) polymerase
- RNA contaminants
- RNA stability
- RNA Integrity Number (RIN)
- Enrichment of polyadenylated RNA molecules
Estos documentos pueden encontrarse en la página DNA/RNA Handling
Reactivos de otros fabricantes
Oxford Nanopore Technologies ha probado y recomienda el uso de todos los reactivos de otros fabricantes citados en este protocolo. No se han evaluado otras alternativas.
Recomendamos preparar estos reactivos siguiendo las instrucciones del fabricante.
Verificar la celda de flujo
Antes de empezar el experimento de secuenciación, recomendamos verificar el número de poros disponibles, presentes en la celda de flujo. La comprobación deberá realizarse en las primeras 12 semanas desde su adquisición, si se trata de celdas de flujo MinION, GridION o PromethION. Oxford Nanopore Technologies sustituirá cualquier celda de flujo —no utilizada—, con un número de poros inferior al indicado en la tabla siguiente, siempre y cuando el resultado se notifique dentro de los dos días siguientes a la comprobación y se hayan seguido las instrucciones de almacenamiento. Para verificar la celda de flujo, siga las instrucciones del documento Flow Cell Check.
| Celda de flujo | Número mínimo de poros activos cubierto por la garantía |
|---|---|
| MinION/GridION | 800 |
| PromethION | 5000 |
Contenido del kit Direct RNA Sequencing Kit (SQK-RNA004):
Nota: Hemos aumentado la concentración de los viales RNA CS (RCS) que se encuentran en los nuevos lotes de SQK-RNA004. Compruebe que sigue el método e indicaciones adecuadas a la concentración de RCS:
| Lote RNA004.20.xxxx o anterior | Lote RNA004.30.0001 o posterior |
|---|---|
| Vial de RNA CS (RCS) de concentración reducida: 15 ng/µl | Vial de RNA CS (RCS) de concentracion aumentada: 50 ng/µl |
| Nombre | Sigla | Color del tapón | No. de viales | Volumen (μl) |
|---|---|---|---|---|
| RT Adapter | RTA | Azul | 1 | 10 |
| RNA Ligation Adapter | RLA | Verde | 1 | 45 |
| RNA CS | RCS | Amarillo | 1 | 25 |
| Wash Buffer | WSB | Naranja | 2 | 1 200 |
| RNA Elution Buffer | REB | Negro | 1 | 300 |
| Library Solution | LIS | tapón blanco, etiqueta rosa | 1 | 600 |
| Sequencing Buffer | SB | Rojo | 1 | 700 |
| RNA Flush Tether | RFT | Rosa | 1 | 200 |
| Flow Cell Flush | FCF | Blanco | 1 | 8 000 |
Nota: El RNA CS (RCS) es la cadena de control y contiene enolasa II, del gen YHR174W, extraído de la levadura saccharomyces cerevisiae. Los archivos de referencia FASTA, correspondientes a las levaduras, están disponibles aquí.
3. Preparación de la biblioteca
Material
- 450 fmol of poly(A)+ enriched RNA sample(s), or 450 fmol of poly(A)-tailed IVT transcript RNA sample(s)
- Reverse Transcription Barcode (RTB)
- EDTA (ácido etilendiaminotetraacético)
- Short Fragment Buffer (SFB)
Consumibles
- T3 DNA Ligase (NEB, M0317)
- Agencourt RNAClean XP beads (Beckman Coulter®, A63987)
- Agua sin nucleasas (p.ej. Thermo Scientific, AM9937)
- 0.2 ml thin-walled PCR tubes or 0.2 ml 96-well PCR plate
- Tubos Eppendorf DNA LoBind de 1,5 ml
Instrumental
- Mezclador vórtex
- Microcentrífuga
- Termociclador
- Hula mixer (mezclador de rotación suave)
- Gradilla magnética
- Cubeta con hielo
- Pipeta y puntas P1000
- Pipeta y puntas P200
- Pipeta y puntas P100
- Pipeta y puntas P20
- Pipeta y puntas P10
- Pipeta y puntas P2
Realizar una comprobación de la celda de flujo
Recomendamos realizar una comprobación de la celda de flujo antes de empezar a preparar la biblioteca y así cerciorarse de que tiene poros suficientes para realizar una buena secuenciación.
Para realizar la comprobación, siga las indicaciones del documento Flow Cell Check
Prepare the reagents acording to the table below:
| Reagent | 1. Thaw at room temperature | 2. Mixing method | 3. Briefly spin down | 4. Store on ice until use |
|---|---|---|---|---|
| T3 DNA Ligase | Not frozen, place directly on ice. | Do not vortex. | ✓ | ✓ |
| StickTogether™ DNA Ligase Buffer | ✓ | Mix by vortexing | ✓ | ✓ |
| EDTA | ✓ | Mix by vortexing | ✓ | ✓ |
| Short Fragment Buffer (SFB) | ✓ | Mix by vortexing | ✓ | ✓ |
| Reverse Transcription Barcodes (RTB) | ✓ | Mix using a plate shaker, by thoroughly flicking the wells, or by individually pipetting the wells you plan on using | ✓ | ✓ |
Note: The StickTogether DNA Ligase Buffer may have a little precipitate. Allow the buffer to come to room temperature and then pipette the buffer up and down several times to break up the precipitate, followed by vortexing the tube for several seconds to ensure the reagent is thoroughly mixed.
The wells of the Reverse Transcription Barcode (RTB) plate are intended for single use only. Please ensure your barcode well is sealed before use, and do not reuse the barcode well once pierced/opened.
Características del kit Direct RNA Sequencing Kit
Este kit se recomienda sobre todo a usuarios que:
- Estén explorando características del ARN como bases modificadas.
- Quieren eliminar sesgos creados por la retrotranscriptasa o la PCR.
- Tienen transcritos que son difíciles de retrotranscribir.
Select a unique Reverse Transcription Barcode (RTB) for each sample to be run together on the same flow cell.
Please note: Up to 24 samples can be barcoded and combined in one experiment. Only use one barcode per sample.
Preparar el ARN en agua sin nucleasas:
- Transferir 300 ng de ARN con cola de poli(A) o 1 μl de ARN total a un tubo de PCR de pared fina (0,2 ml).
- Ajustar el volumen a un total de 8 μl con agua sin nucleasas.
- Mezclar golpeando suavemente el tubo con el dedo para evitar fragmentaciones indeseadas.
- Centrifugar brevemente.
In the 0.2 ml PCR-tubes or a 96-well plate containing your RNA samples, add the reagents in the following order per well:
| Reagent | Volume |
|---|---|
| RNA sample (from previous step) | 5 µl |
| StickTogether Ligase Buffer (2x) | 7.5 µl |
| Reverse Transcription Barcode (RTB) | 1 µl |
| T3 DNA Ligase | 1.5 µl |
| Total | 15 µl |
Thoroughly mix the reaction by flicking and briefly spinning down.
Incubate the reaction(s) for 20 minutes at 25°C using a thermal cycler.
Remove the reaction(s) from the thermal cylcer.
Add 1 µl of EDTA (EDTA) to each sample, mix by flicking ensuring the reaction is homogenised, and briefly spin down the samples.
EDTA is added at this step to stop the ligation reaction before sample pooling.
Note: If this reaction is not performed, you will increase the likelihood of barcode cross-contamination.
Incubate the reaction(s) for 5 minutes at room temperature.
Briefly spin down your samples, and pool all the Reverse Transcription Barcoded samples in a clean 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind tube.
Resuspend the RNAClean AMPure XP beads by vortexing.
Add 1X volume of the RNAClean AMPure XP beads to the pooled samples, and mix by flicking.
Follow the table below for volume guidance depending on the number of samples multiplexed:
| Number of samples multiplexed | Volume of samples pooled | Volume of beads added to samples | Total final volume in tube |
|---|---|---|---|
| 4 | 64 µl | 64 µl | 128 µl |
| 6 | 96 µl | 96 µl | 192 µl |
| 8 | 128 µl | 128 µl | 256 µl |
| 12 | 192 µl | 192 µl | 384 µl |
| 24 | 384 µl | 384 µl | 768 µl |
Incubate on a Hula mixer (rotator mixer) for 10 minutes at room temperature.
Briefly vortex the Short Fragment Buffer (SFB).
Remove your pooled samples from the Hula mixer, briefly spin down, and pellet on a magnet for 5–10 minutes. Keep the tube on the magnetic rack until the eluate is clear and colourless, and pipette off the supernatant.
Tip: ~10 µl of the supernatant can be left behind to avoid dislodging the beads.
Wash the beads using 500 µl of Short Fragment Buffer (SFB). Flick the beads to resuspend, spin down, then return the sample to the magnetic rack and allow the beads to pellet for at least 5 minutes, until the buffer is clear. Remove the buffer using a pipette and discard.
Spin down and place the tube back on the magnetic rack. Pipette off any residual buffer using a P20 pipette.
Allow the pellet to dry for ~30 seconds, but do not dry the pellet to the point of cracking.
Remove the tube from the magnetic rack and resuspend the pellet in nuclease-free water following the guidance below. Mix by gently flicking tube and briefly spin down.
Follow the table below for volume guidance depending on the number of samples multiplexed:
| Number of samples multiplexed | Volume of nuclease-free water used in the elution |
|---|---|
| 1–8 | 28 µl |
| 9–16 | 56 µl |
| 17–24 | 84 µl |
Incubate the elution for 10 minutes at room temperature.
Pellet the beads on a magnetic rack for 5 minutes, until the eluate is clear and colourless
Remove and retain the full volume of eluate into a clean 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind tube.
Take forward the Reverse Transcription Barcode adapted RNA samples to the reverse transcription step.
4. Preparación de la biblioteca
Material
- Reverse Transcription Barcode adapted RNA samples
- Short Fragment Buffer (SFB)
Consumibles
- Induro® Reverse Transcriptase y 5 Induro® RT Reaction Buffer (NEB, M0681)
- 10 mM dNTP solution (e.g. NEB N0447)
- Inhibidor de RNasa murino (NEB, M0314)
- Agencourt RNAClean XP beads (Beckman Coulter®, A63987)
- Agua sin nucleasas (p.ej. Thermo Scientific, AM9937)
- Tubos de PCR de pared fina, 0,2 ml
- Tubos Eppendorf DNA LoBind de 1,5 ml
Instrumental
- Mezclador vórtex
- Microcentrífuga
- Termociclador
- Hula mixer (mezclador de rotación suave)
- Gradilla magnética
- Cubeta con hielo
- Pipeta y puntas P1000
- Pipeta y puntas P200
- Pipeta y puntas P100
- Pipeta y puntas P20
- Pipeta y puntas P10
- Pipeta y puntas P2
Prepare the reagents acording to the table below:
| Reagent | 1. Thaw at room temperature | 2. Briefly spin down | 3. Mix well by pipetting | 4. Store on ice until use |
|---|---|---|---|---|
| Induro RT Buffer (5x) | ✓ | ✓ | ✓ | ✓ |
| 10 mM dNTP solution | ✓ | ✓ | ✓ | ✓ |
| Murine RNase Inhibitor | ✓ | ✓ | ✓ | ✓ |
| Induro Reverse Transcriptase | ✓ | ✓ | ✓ | ✓ |
| Short Fragment Buffer (SFB) | ✓ | ✓ | ✓ | Not required |
The reverse transcription reaction is performed in split reactions when multiplexing >8 samples to ensure optimal sample-to-reagent ratios.
Please follow the guidance in the steps below.
Preparar la reacción del adaptador —RT Adapter (RTA)— de la siguiente manera:
Si se opta por no utilizar RNA CS (RCS) en la muestra inicial, sustituir el volumen en la mezcla de reacción RTA con agua sin nucleasas.
Uso de RNA CS de concentracion aumentada: disponible en lotes RNA004.30.0001 o posterior:
1. En un tubo de PCR de pared fina (0,2 ml), diluir al RNA CS (RCS) de entrada como se indica a continuación:
| Reactivo | Volumen |
|---|---|
| RNA CS (RCS) | 1 µl |
| Agua sin nucleasas | 2 µl |
| Total | 3 µl |
2. Mezclar con la pipeta al menos 10 veces hasta asegurarse de que esté bien mezclado.
3. En el tubo de PCR de pared fina (0,2 ml) que contiene la muestra de ARN, combinar los reactivos en el siguiente orden:
| Reactivo | Volumen |
|---|---|
| ARN del paso anterior | 8 µl |
| NEBNext Quick Ligation Reaction Buffer | 3 µl |
| RNA CS (RCS) diluido o agua sin nucleasas | 0.5 µl |
| Murine RNase Inhibitor | 1 µl |
| RT Adapter (RTA) | 1 µl |
| T4 DNA Ligase | 1.5 µl |
| Total | 15 µl |
Uso de RNA CS de concentracion reducida: disponible en lotes RNA004.20.xxxx o posterior:
1. En el tubo de PCR que contiene la muestra de ARN, combinar los reactivos en el siguiente orden:
| Reactivo | Volumen |
|---|---|
| ARN | 8 µl |
| NEBNext Quick Ligation Reaction Buffer | 3 µl |
| RNA CS (RCS) o agua sin nuecleasas | 0,5 µl |
| Murine RNase Inhibitor | 1 µl |
| RT Adapter (RTA) | 1 µl |
| T4 DNA Ligase | 1,5 µl |
| Total | 15 µl |
Preparar la reacción del adaptador —RT Adapter (RTA)— de la siguiente manera:
Si se opta por no utilizar RNA CS (RCS) en la muestra inicial, sustituir el volumen en la mezcla de reacción RTA con agua sin nucleasas.
Uso de RNA CS de concentracion aumentada: disponible en lotes RNA004.30.0001 o posterior:
1. En un tubo de PCR de pared fina (0,2 ml), diluir al RNA CS (RCS) de entrada como se indica a continuación:
| Reactivo | Volumen |
|---|---|
| RNA CS (RCS) | 1 µl |
| Agua sin nucleasas | 2 µl |
| Total | 3 µl |
2. Mezclar con la pipeta al menos 10 veces hasta asegurarse de que esté bien mezclado.
3. En el tubo de PCR de pared fina (0,2 ml) que contiene la muestra de ARN, combinar los reactivos en el siguiente orden:
| Reactivo | Volumen |
|---|---|
| ARN del paso anterior | 8 µl |
| NEBNext Quick Ligation Reaction Buffer | 3 µl |
| RNA CS (RCS) diluido o agua sin nucleasas | 0.5 µl |
| Murine RNase Inhibitor | 1 µl |
| RT Adapter (RTA) | 1 µl |
| T4 DNA Ligase | 1.5 µl |
| Total | 15 µl |
Uso de RNA CS de concentracion reducida: disponible en lotes RNA004.20.xxxx o posterior:
1. En el tubo de PCR que contiene la muestra de ARN, combinar los reactivos en el siguiente orden:
| Reactivo | Volumen |
|---|---|
| ARN | 8 µl |
| NEBNext Quick Ligation Reaction Buffer | 3 µl |
| RNA CS (RCS) o agua sin nuecleasas | 0,5 µl |
| Murine RNase Inhibitor | 1 µl |
| RT Adapter (RTA) | 1 µl |
| T4 DNA Ligase | 1,5 µl |
| Total | 15 µl |
To each reverse transcription reaction add 2 µl of Induro Reverse Transcriptase. Mix gently by pipetting until the sample is thoroughly mixed.
Please note, you will have a different number of reactions depending on the number of samples multiplexed.
- For up to 8 samples, 1 reaction
- For 9–16 samples, 2 reactions
- For 17–24 samples, 3 reactions
Incubate reaction(s) in a thermal cycler for 30 minutes at 60°C followed by 10 minutes at 70°C.
Transfer your samples into a clean 1.5 mL Eppendorf LoBind DNA tube.
Note: Pool all your reaction(s) into the same tube if you are running more than 8 barcodes and have split the reverse transcription reaction.
| Number of samples | Number of reactions pooled | Final pooled volume |
|---|---|---|
| 1–8 samples | 1 | 40.4 µl |
| 9–16 samples | 2 | 80.8 µl |
| 17–24 samples | 3 | 121.2 µl |
Resuspend the RNAClean AMPure XP beads by vortexing.
Add 1.5X volume of the RNAClean AMPure XP beads to the pooled samples, and mix by flicking.
Incubate on a Hula mixer (rotator mixer) for 10 minutes at room temperature.
Briefly vortex the Short Fragment Buffer (SFB).
Remove your pooled samples from the Hula mixer, briefly spin down, and pellet on a magnet for 5-10 minutes. Keep the tube on the magnetic rack until the eluate is clear and colourless, and pipette off the supernatant.
Tip: ~10 µl of the supernatant can be left behind to avoid dislodging the beads.
Wash the beads using 150 µl of Short Fragment Buffer (SFB). Flick the beads to resuspend, spin down, then return the sample to the magnetic rack and allow the beads to pellet. Remove the buffer using a pipette and discard.
Spin down and place the tube back on the magnetic rack. Pipette off any residual buffer using a P20 pipette.
Allow the pellet to dry for ~30 seconds, but do not dry the pellet to the point of cracking.
Remove the tube from the magnetic rack and resuspend the pellet in 41 µl of nuclease-free water. Mix by gently flicking tube and briefly spin down.
Incubate the elution for 10 minutes at room temperature.
Pellet the beads on a magnetic rack for 5 minutes, until the eluate is clear and colourless
Remove and retain the full volume of eluate into a clean 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind tube.
Quantify 1 µl of eluted sample using a Qubit fluorometer and the Qubit dsDNA HS kit.
- Expected recovery for poly(A)+ enriched RNA samples: 400–600 ng in a 4-plex prep.
- Expected recovery for poly(A)-tailed IVT transcripts: 800–1000 ng in a 12-plex prep.
- Expected recovery for poly(A)-tailed IVT transcripts: 1600–2000 ng in a 24-plex prep.
Take forward your reverse transcribed samples to the excess barcode inactivation step.
5. Preparación de la biblioteca
Material
- Reverse transcribed RNA samples
- Short Fragment Buffer (SFB)
Consumibles
- rCutSmart™ Buffer (NEB, B6004S)
- USER (Uracil-Specific Excision Reagent) Enzyme (NEB, cat # M5505L)
- Agencourt RNAClean XP beads (Beckman Coulter®, A63987)
- Agua sin nucleasas (p.ej. Thermo Scientific, AM9937)
- Tubos de PCR de pared fina, 0,2 ml
- Tubos Eppendorf DNA LoBind de 1,5 ml
- Qubit RNA HS Assay Kit (ThermoFisher, Q32852)
- Qubit™ dsDNA HS Assay Kit (ThermoFisher, Q32851)
- Tubos Qubit™ Assay (Invitrogen, Q32856)
Instrumental
- Mezclador vórtex
- Microcentrífuga
- Hula mixer (mezclador de rotación suave)
- Gradilla magnética
- Fluorímetro Qubit™ (o equivalente para el control de calidad)
- Cubeta con hielo
- Pipeta y puntas P1000
- Pipeta y puntas P200
- Pipeta y puntas P100
- Pipeta y puntas P20
- Pipeta y puntas P10
- Pipeta y puntas P2
- Centrifuga Eppendorf 5424 (o equivalente)
- Thermomixer or heat block
Prepare the reagents acording to the table below:
| Reagent | 1. Thaw at room temperature | 2. Briefly spin down | 3. Mix well by pipetting | 4. Store on ice until use |
|---|---|---|---|---|
| rCutSmart buffer | ✓ | ✓ | ✓ | Not required |
| USER enzyme | Not frozen | ✓ | ✓ | ✓ |
| Short Fragment Buffer (SFB) | ✓ | ✓ | ✓ | Not required |
Set up the reaction in the tube containing your reverse transcribed samples:
Optional: The reaction can be set up in the same 1.5 ml Eppendorf tube from the previous step. But if your thermal cycler or heat block is only suitable for 0.2 ml PCR tubes, you can transfer the samples and set up the reaction in the consumable suitable for your equipment.
| Reagent | Volume |
|---|---|
| Reverse transcribed RNA samples (from previous step) | 40 µl |
| rCutSmart buffer | 5 µl |
| USER enzyme | 5 µl |
| Total | 50 µl |
Incubate the reaction for 30 minutes at 37°C.
Optional: Once the incubation is completed, if you have performed the reaction in a 0.2 ml PCR tube we suggest transferring the full volume back to a clean 1.5 ml Eppendorf LoBind tube for the clean-up steps.
Resuspend the RNAClean AMPure XP beads by vortexing.
Add 75 µl of the RNAClean AMPure XP beads to the sample tube, and mix by flicking.
Incubate on a Hula mixer (rotator mixer) for 10 minutes at room temperature.
Briefly vortex the Short Fragment Buffer (SFB).
Remove your pooled samples from the Hula mixer, briefly spin down, and pellet on a magnet for 5-10 minutes. Keep the tube on the magnetic rack until the eluate is clear and colourless, and pipette off the supernatant.
Tip: ~10 µl of the supernatant can be left behind to avoid dislodging the beads.
Wash the beads with 150 µl of Short Fragment Buffer (SFB). Flick the beads to fully resuspend the pellet, spin down, then return the sample to the magnetic rack and allow the beads to pellet. Remove the buffer using a pipette and discard.
Note: Leave behind ~10 µl of supernatant, to avoid dislodging the beads.
Repeat the previous step.
Spin down and place the tube back on the magnetic rack. Pipette off any residual buffer.
Allow to dry for ~30 seconds, but do not dry the pellet to the point of cracking.
Remove the tube from the magnetic rack and resuspend the pellet in 21 µl nuclease-free water by gently flicking.
Incubate for 10 minutes at room temperature.
Pellet the beads on a magnetic rack for 5 minutes, until the eluate is clear and colourless.
Remove and retain 21 µl of eluate into a clean 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind tube.
Quantify 1 µl of eluted sample using a Qubit fluorometer and the Qubit dsDNA HS kit.
- Expected recovery for poly(A)+ enriched RNA samples: 300–500 ng in a 4-plex prep.
- Expected recovery for poly(A)-tailed IVT transcripts: 450–650 ng in a 12-plex prep.
- Expected recovery for poly(A)-tailed IVT transcripts: 900–1300 ng in a 24-plex prep.
Please note: You may not be carrying forward the full amount of your RNA sample into the final sequencing adapter ligation step. Please follow the recommendations in the steps below for optimal reaction efficiency and flow cell loading occupancy to maximise output.
The excess prepared RNA library from this stage can be stored at -80°C as a checkpoint.
Take forward your prepared samples to the sequencing adapter ligation step.
Pause option: At this stage the samples can be stored overnight at -80°C.
6. Preparación de la biblioteca
Material
- Reverse transcribed and sacrificial strand digested RNA samples
- RNA Barcode Adapter (RBA)
- RNA Elution Buffer (REB)
- Short Fragment Buffer (SFB)
- Displacement Strand (DS)
Consumibles
- T3 DNA Ligase (NEB, M0317)
- 5M NaCl, RNase-free (ThermoFisher, 10609823 or equivalent)
- Agencourt RNAClean XP beads (Beckman Coulter®, A63987)
- Agua sin nucleasas (p.ej. Thermo Scientific, AM9937)
- Tubos Eppendorf DNA LoBind de 1,5 ml
- Qubit™ dsDNA HS Assay Kit (ThermoFisher, Q32851)
- Tubos Qubit™ Assay (Invitrogen, Q32856)
Instrumental
- Mezclador vórtex
- Microcentrífuga
- Termociclador
- Thermomixer or heat block
- Hula mixer (mezclador de rotación suave)
- Gradilla magnética
- Fluorímetro Qubit™ (o equivalente para el control de calidad)
- Cubeta con hielo
- Pipeta y puntas P1000
- Pipeta y puntas P200
- Pipeta y puntas P100
- Pipeta y puntas P20
- Pipeta y puntas P10
- Pipeta y puntas P2
- Centrifuga Eppendorf 5424 (o equivalente)
Prepare the reagents acording to the table below:
| Reagent | 1. Thaw at room temperature | 2. Briefly spin down | 3. Mix well by pipetting | 4. Store on ice until use |
|---|---|---|---|---|
| StickTogether Ligase Buffer | ✓ | ✓ | ✓ | ✓ |
| T3 DNA Ligase | Not frozen | ✓ | ✓ | ✓ |
| RNA Barcode Adapter (RBA) | Not frozen | ✓ | ✓ | ✓ |
| Short Fragment Buffer (SFB) | ✓ | ✓ | ✓ | Not required |
| RNA Elution Buffer (REB) | ✓ | ✓ | ✓ | Not required |
| Displacement Strand (DS) | ✓ | ✓ | ✓ | ✓ |
Please note the RNA library input into sequenicng adapter ligation is recommended based on the optimal performance results from our internal testing.
- For poly(A) enriched RNA samples, our internal input testing was performed on ~2.4 kb poly(A) selected UHRR.
- For poly(A) tailed IVT transcript samples, our internal input testing was performed on 1–1.2 kb IVT transcripts.
We recommend following the input guidance below for your initial experiments. Further input optimisation may be beneficial for samples of different lengths.
En el mismo tubo Eppendorf DNA LoBind de 1,5 ml, combinar los reactivos en el siguiente orden:
| Reactivo | Volumen |
|---|---|
| Muestra ARN-RT | 23 µl |
| NEBNext Quick Ligation Reaction Buffer | 8 µl |
| RNA Ligation Adapter (RLA) | 6 µl |
| T4 DNA Ligase | 3 µl |
| Total | 40 µl |
En el mismo tubo Eppendorf DNA LoBind de 1,5 ml, combinar los reactivos en el siguiente orden:
| Reactivo | Volumen |
|---|---|
| Muestra ARN-RT | 23 µl |
| NEBNext Quick Ligation Reaction Buffer | 8 µl |
| RNA Ligation Adapter (RLA) | 6 µl |
| T4 DNA Ligase | 3 µl |
| Total | 40 µl |
Mezclar con la pipeta.
Incubar la reacción durante 10 minutos a temperatura ambiente.
In a clean 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind tube, prepare 1.4 M NaCl for your sample as follows and mix thoroughly by pipetting:
| Reagent | Volume |
|---|---|
| 5M NaCl | 14 µl |
| Nuclease-free water | 36 µl |
| Total volume of 1.4M NaCl | 50 µl |
Add 40 µl of the prepared 1.4M NaCl to your sequencing adapter ligated sample library.
Resuspender las microesferas Agencourt RNAClean XP mediante vórtex.
Añadir 16 μl de microesferas Agencourt RNAClean XP resuspendidas, a la reacción de transcripción inversa y mezclar con la pipeta.
Incubar en el hula mixer (o mezclador rotatorio) durante 5 minutos a temperatura ambiente.
Briefly vortex the Short Fragment Buffer (SFB).
Remove your pooled samples from the Hula mixer, briefly spin down, and pellet on a magnet for 5-10 minutes. Keep the tube on the magnetic rack until the eluate is clear and colourless, and pipette off the supernatant.
Tip: ~10 µl of the supernatant can be left behind to avoid dislodging the beads.
Wash the beads with 150 µl of Short Fragment Buffer (SFB). Flick the beads to fully resuspend the pellet, spin down, then return the sample to the magnetic rack and allow the beads to pellet (for at least 5–10 minutes). Remove the buffer using a pipette and discard.
Note: Leave behind ~10 µl of supernatant, to avoid dislodging the beads.
Repeat the previous step.
Spin down and place the tube back on the magnetic rack. Pipette off any residual buffer.
Allow to dry for ~30 seconds, but do not dry the pellet to the point of cracking.
Retirar el tubo de la gradilla magnética y resuspender el sedimento en 13 μl de RNA Elution Buffer (REB), dando suaves golpes al tubo con el dedo. Incubar durante 10 minutos a temperatura ambiente.
Pellet the beads on a magnetic rack for 5 minutes, until the eluate is clear and colourless.
Extraer 13 µl de eluido y guardarlo en un tubo Eppendorf DNA Lobind de 1,5 ml.
Cuantificar 1 μl de ARN retrotranscrito y adaptado en el fluorímetro Qubit™, con ayuda del ensayo Qubit™ dsDNA HS.
La cantidad de eluido final que se desea recuperar es > 30 ng. code Las cantidades recogidas varían según las diferentes cantidades de muestra y las preparaciones de bibliotecas. No obstante, recomendamos utilizar el volumen completo de ARN para obtener los mejores resultados en la secuenciación.
The Displacement Strand (DS) added below greatly reduces any free sequencing adapter found in your RNA library.
This greatly improves pore occupancy and output on your flow cell.
Add 1 µl of Displacement Strand (DS) to your RNA library. Incubate for at least 5 minutes at room temperature.
El ARN retranscrito y adaptado está listo para cargar la celda de flujo.
La biblioteca de ARN debe secuenciarse inmediatamente y no se puede guardar para utilizarse más adelante.
7. Acondicionar y cargar la celda de flujo MinION/GridION
Material
- Library Solution (LIS)
- Sequencing Buffer (SB)
- RNA Flush Tether (RFT)
- Flow Cell Flush (FCF)
Consumibles
- MinION/GridION Flow Cell RNA (FLO-MIN004RA)
- Tubos Eppendorf DNA LoBind de 1,5 ml
Instrumental
- MinION or GridION device
- MinION/GridION Flow Cell Light Shield
- Mezclador vórtex
- Microcentrífuga
- Pipeta y puntas P1000
- Pipeta y puntas P200
- Pipeta y puntas P100
- Pipeta y puntas P20
Nótese, este kit es compatible solo con las celdas de flujo para ARN (FLO-MIN004RA).
Sacar la celda de flujo de la nevera y dejarla a temperatura ambiente durante 20 minutos, mejorará la visibilidad de la matriz durante el acondicionamiento y carga de la muestra.
Acondicionar y cargar la celda de flujo
Recomendamos mirar el vídeo Cómo cargar celdas de flujo antes de realizar el primer experimento.
Descongelar los viales Sequencing Buffer (SB), Library Solution (LIS), RNA Flush Tether (RFT) y un tubo de Flow Cell Flush (FCF) a temperatura ambiente. Agitar en vórtex y centrifugar brevemente.
En un tubo nuevo de 1,5 ml Eppendorf DNA Lobind mezclar los siguientes reactivos. Agitar en vórtex y centrifugar brevemente.
| Reactivos | Volumen por celda de flujo |
|---|---|
| RNA Flush Tether (RFT) | 30 µl |
| Flow Cell Flush (FCF) | 1 170 µl |
| Total | 1 200 µl |
Abrir la tapa del dispositivo MinION o GridION y deslizar la celda de flujo debajo del clip. Presionar la celda de flujo con firmeza para asegurar un contacto eléctrico y térmico adecuados.
Antes de cargar la biblioteca, verificar la celda de flujo para determinar el número de poros disponible.
Si se ha verificado la celda de flujo con anterioridad, este paso se puede omitir.
Dispone de más información en las instrucciones de comprobación de la celda de flujo, del protocolo de MinKNOW.
Deslizar la tapa del puerto de purgado en el sentido de las agujas del reloj.
Tenga cuidado a la hora de extraer solución amortiguadora de la celda de flujo. No retire más de 20-30 μl y asegúrese de que la solución cubra la matriz de poros en todo momento. La introducción de burbujas de aire en la matriz puede dañar los poros de manera irreversible.
Tras abrir el puerto de purgado, comprobar si hay burbujas de aire bajo la tapa. Retirar una pequeña cantidad de solución amortiguadora para quitar las burbujas:
- Ajustar una pipeta P1000 a 200 μl.
- Introducir la punta de la pipeta en el puerto de purgado.
- Girar la rueda hasta que el indicador de volumen marque 220-230 μl o hasta que se pueda ver una pequeña cantidad de solución amortiguadora entrar en la punta de la pipeta.
Nota: Comprobar que haya un flujo continuo de solución amortiguadora circulando desde el puerto de purgado a través de la matriz de poros.
Cargar 800 μl de mezcla de acondicionamiento por del puerto de purgado, evitando introducir burbujas de aire. Esperar cinco minutos. Durante este tiempo, preparar la biblioteca para cargar siguiendo los pasos a continuación.
En un tubo de 1,5 ml preparar la biblioteca de la siguiente manera:
| Reactivo | Volumen por celda de flujo |
|---|---|
| Sequencing Buffer (SB) | 37,5 µl |
| Library Solution (LIS) | 25,5 µl |
| Biblioteca de ARN | 12 µl |
| Total | 75 µl |
Terminar de acondicionar la celda de flujo:
- Levantar con suavidad la tapa del puerto de carga SpotON.
- Cargar 200 µl de mezcla de acondicionamiento en el puerto de purgado (no en el puerto SpotON), evitando introducir burbujas de aire.
Mezclar la biblioteca suavemente con la pipeta, justo antes de cargar.
Añadir, gota a gota, 75 μl de la biblioteca preparada en el puerto SpotON de la celda de flujo. Procurar que cada gota fluya hacia adentro del puerto antes de añadir la siguiente.
Volver a colocar con cuidado, la tapa del puerto SpotON, procurando que el tapón encaje en el agujero y cerrar el puerto de purgado.
Para obtener resultados de secuenciación óptimos, coloque la pantalla protectora sobre la celda de flujo justo después de cargar la biblioteca.
Recomendamos colocar la pantalla protectora en la celda de flujo y dejarla puesta mientras la biblioteca esté cargada, incluyendo los lavados y pasos de recarga. Retirar la pantalla cuando se haya extraído la biblioteca de la celda de flujo.
Colocar la pantalla protectora de la siguiente manera:
Colocar con cuidado el borde delantero de la pantalla protectora contra el clip. Nota: No hacer fuerza sobre ella.
Posar la pantalla protectora sobre la celda de flujo. La pieza debe asentarse alrededor de la tapa SpotON y cubrir por completo la sección superior de la celda de flujo.
La pantalla protectora no está fijada a la celda de flujo. Una vez colocada, es necesario manipular la celda de flujo con cuidado.
Cerrar la tapa del dispositivo y configurar un experimento de secuenciación en MinKNOW.
Al insertar una celda de flujo en el MinION Mk1D, la tapa del dispositivo se asentará sobre ella dejando un pequeño espacio perimetral. Ello es normal y no afecta al funcionamiento del dispositivo.
Encontrará más información en este enlace.
8. Adquisición de datos e identificación de bases
Cómo empezar a secuenciar
Una vez la celda de flujo esté cargada, el experimento se pone en marcha desde MinKNOW, el programa de secuenciación que controla el dispositivo, la adquisición de datos y la identificación de bases en tiempo real. Encontrará intrucciones de uso más detalladas en el protocolo de MinKNOW.
Es posible utilizar y configurar MinKNOW para secuenciar de diferentes maneras:
- En un ordenador conectado a un dispositivo de secuenciación, ya sea directamente o a distancia.
- Directamente desde un dispositivo de secuenciación GridION, MinION Mk1C o PromethION 24/48.
Encontrará más información sobre el uso de MinKNOW en los manuales de usuario de los dispositivos:
Cómo empezar un experimento de secuenciación en MinKNOW:
1. Ir a la página principal y pulsar "Iniciar secuenciación".
2. Introducir los datos del experimento, como el nombre, la posición de la celda de flujo y el identificador de la muestra.
3. En la pestaña Kit, seleccionar Direct RNA Sequencing Kit (SQK-RNA004).
4. En la pestaña Configuración del experimento, ajustar los parámetros de secuenciación y salida del experimento o mantener la configuración por defecto.
Nota: Si la identificación de bases estaba desactivada durante la configuración de un experimento, es posible identificar las bases tras la ejecución en MinKNOW. Para más información, consulte el protocolo de MinKNOW.
5. En la página Inicio, pulsar en la casilla Iniciar la secuenciación.
Análisis de datos
Una vez la secuenciación ha finalizado, es posible reutilizar o devolver la celda de flujo, como se describe en la sección sobre Reutilización o retorno de celdas de flujo.
Tras secuenciar e identificar las bases, es posible analizar los datos. Si desea más información sobre las opciones de análisis disponible durante y tras la identificación de bases, consulte el documento Data Analysis.
En la sección Análisis, se describen otras opciones para analizar los datos.
9. Reutilización y devolución de celdas de flujo
El kit Flow Cell Wash Kit (EXP-WSH004 o EXP-WSH004-XL) es compatible con las celdas de flujo de ARN y el kit Direct RNA Sequencing Kit (SQK-RNA004).
No obstante, tenga en cuenta que:
- La DNasa presente en el kit de lavado no ayudará a recuperar los poros bloqueados en la celda de flujo, tras la secuenciación directa de ARN.
- En su lugar, lavará la mayoría de la biblioteca de la matriz y quitará todo el adaptador de la muestra restante, evitando que se vuelva a capturar y secuenciar, lo que permitirá cargar una biblioteca posteriormente.
Otra posibilidad es seguir el procedimiento de devolución, lavar la celda de flujo y enviarla a Oxford Nanopore.
Aquí están las instrucciones para devolver celdas de flujo.
Ante cualquier duda o pregunta acerca del experimento de secuenciación, consulte la sección Resolución de problemas, que se encuentra en la versión en línea de este protocolo.
10. Análisis de datos
Análisis posterior a la identificación de bases
Existen varias opciones para completar el análisis de los datos de bases identificadas:
Flujos de trabajo de EPI2ME
A fin de realizar un análisis en profundidad de los datos, Oxford Nanopore Technologies ofrece una serie de tutoriales sobre bioinformática y flujos de trabajo, que están disponibles en EPI2ME. La plataforma proporciona un espacio donde los flujos de trabajo que depositan en GitHub nuestros equipos de Investigación y Aplicaciones, se pueden exponer con textos descriptivos, código bioinformático funcional y datos de ejemplo.
Herramientas de análisis para la investigación
Para realizar un análisis de datos más exhaustivo, Oxford Nanopore Technologies ofrece una serie de tutoriales y flujos de trabajo bioinformáticos, disponibles en EPI2ME Labs, que encontrará en la sección del mismo nombre de la comunidad Nanopore. La plataforma proporciona un espacio donde los proyectos que depositan en GitHub nuestros equipos de Investigación y Aplicaciones, se pueden exponer con textos descriptivos, código bioinformático funcional y datos de ejemplo.
Herramientas de análisis desarrolladas por la comunidad
Si no se proporciona en ninguno de los recursos anteriores un método de análisis que responda a las necesidades de investigación requeridas, consulte el centro de recursos Resource Centre y busque herramientas bioinformáticas para su aplicación. Varios miembros de la comunidad Nanopore han desarrollado sus propias herramientas y cartera de productos en desarrollo para analizar los datos de la secuenciación por nanoporos. La mayoría de ellas está disponible en GitHub. Oxford Nanopore Technologies no desarrolla ni mantiene esas herramientas y no garantiza que sean compatibles con la última configuración de química/programas informáticos.
11. Problemas durante la extracción de ARN y preparación de la biblioteca
A continuación hay una lista de los problemas más frecuentes, con algunas posibles causas y soluciones propuestas.
También disponemos de una página de preguntas frecuentes, FAQ, en la sección Support de la comunidad Nanopore.
Si ha probado las soluciones propuestas y continúa teniendo problemas, póngase en contacto con el departamento de asistencia técnica, bien por correo electrónico (support@nanoporetech.com) o a través del chat Live Support de la comunidad Nanopore.
Baja calidad de la muestra
| Observaciones | Possibles causas | Comentarios y acciones recomendadas |
|---|---|---|
| Baja integridad del ARN (número de integridad del ARN <9,5 RIN o la banda ARNr se muestra como una mancha en el gel) | El ARN se degradó durante la extracción. | Probar un método de extracción de ARN diferente. Para más información sobre el tema, consulte el documento RNA Integrity Number (NIN). Encontrará más información en la página DNA/RNA Handling. |
| El ARN tiene una longitud de fragmento más corta de lo esperado | El ARN se degradó durante la extracción | Para más información sobre el tema, consulte el documento RNA Integrity Number (NIN). Encontrará más información en la página DNA/RNA Handling. Cuando se trabaje con ARN, recomendamos que el ambiente en el que se trabaje, incluido el instrumental de laboratorio, estén libres de ribonucleasas. |
12. Problemas durante la secuenciación de ARN
A continuación hay una lista de los problemas más frecuentes, con algunas posibles causas y soluciones propuestas.
También disponemos de una página de preguntas frecuentes, FAQ, en la sección Support de la comunidad Nanopore.
Si ha probado las soluciones propuestas y continúa teniendo problemas, póngase en contacto con el departamento de asistencia técnica, bien por correo electrónico (support@nanoporetech.com) o a través del chat Live Support de la comunidad Nanopore.
Menos poros al inicio de la secuenciación que tras la evaluación de la celda de flujo
| Observaciones | Posibles causas | Comentarios y acciones recomendadas |
|---|---|---|
| MinKNOW presentó al inicio de la secuenciación un número de poros inferior al indicado durante la evaluación de la celda de flujo | Se introdujo una burbuja de aire en la matriz de nanoporos | Tras comprobar el número de poros presente en la celda de flujo y antes de cebarla, es imprescindible quitar las burbujas que haya cerca del puerto de cebado. Si no se quitan, las burbujas de aire pueden desplazarse a la matriz de nanoporos y dañar de manera irreversible los nanoporos expuestos al aire. La forma más eficaz de evitar que esto ocurra se muestra en los vídeos Cómo cargar celdas de flujo MinION y Cómo cargar celdas de flujo PromethION. |
| MinKNOW presentó al inicio de la secuenciación un número de poros inferior al indicado durante la evaluación de la celda de flujo | La celda de flujo no está colocada correctamente | Detener el ciclo de secuenciación, quitar la celda de flujo del dispositivo e insertarla de nuevo. Comprobar que está firmemente asentada en el dispositivo y que ha alcanzado la temperatura deseada. Si procede, probar a colocarla en una posición diferente (GridION/PromethION). |
| MinKNOW presentó al inicio de la secuenciación un número de poros inferior al indicado durante la evaluación de la celda de flujo | La presencia de contaminantes en la biblioteca puede haber dañado o bloqueado los poros | El número de poros resultante tras la evaluación de la celda de flujo se realiza usando el control de calidad (CC) de las moléculas de ADN presentes en el tampón de almacenamiento de la celda de flujo. Al inicio de la secuenciación, se utiliza la misma biblioteca para estimar el número de poros activos. Por este motivo, se estima que puede haber una variabilidad del 10 % en el número de poros detectados. Tener un número de poros considerablemente inferior al inicio de la secuenciación puede deberse a la presencia de contaminantes en la biblioteca que hayan dañado las membranas o bloqueado los poros. Para mejorar la pureza del material de entrada, tal vez sea necesario usar métodos de purificación o extracción de ARN alternativos. Los efectos de los contaminantes se muestran en la página Contaminants. Probar con un método de extracción alternativo que no provoque el arrastre de contaminantes. |
Error en el script de MinKNOW
| Observaciones | Posibles causas | Comentarios y acciones recomendadas |
|---|---|---|
| MinKNOW muestra el mensaje "Error en el script" | Reiniciar el ordenador y reiniciar MinKNOW. Si el problema continúa, reúna los archivos de registro MinKNOW log files y contacte con el servicio de asistencia técnica. Si no dispone de otro dispositivo de secuenciación, recomendamos que guarde la celda de flujo cargada a 4 °C y contacte con el servicio de asistencia técnica para recibir instrucciones de almacenamiento adicionales. |
Ocupación de poros por debajo del 40 %
| Observaciones | Posibles causas | Comentarios y acciones recomendadas |
|---|---|---|
| Ocupación de poros inferior al 40 % | No se cargó suficiente cantidad de biblioteca en la celda de flujo | Procure cargar la cantidad de biblioteca de buena calidad recomendada en la preparación de la biblioteca del protocolo correspondiente. Cuantificar la biblioteca antes de cargarla y calcular los moles con herramientas como la calculadora NEBio, opción "RNA ss: mass to moles". |
| Ocupación de los poros próxima a 0 | No hay anclaje en la celda de flujo | Los anclajes se añaden durante el cebado de la celda de flujo (vial FCT) No olvide añadir Flow Cell Tether (FCT) al Flow Cell Flush (FCF) antes del cebado. |
Gran proporción de poros inactivos
| Observaciones | Posibles causas | Comentarios y acciones recomendadas |
|---|---|---|
| Gran proporción de poros inactivos o poros no disponibles (se muestran en azul claro en el panel de canales y en el gráfico de actividad de poros. Los poros o membranas están irreversiblemente dañados) | Se han introducido burbujas de aire en la celda de flujo | Las burbujas de aire introducidas durante el cebado de la celda y la carga de la biblioteca pueden dañar los poros de manera irreversible. La forma más eficaz de evitar que esto ocurra se muestra en los vídeos Cómo cargar celdas de flujo MinION y Cómo cargar celdas de flujo PromethION. |
| Gran proporción de poros inactivos/no disponibles | Hay contaminantes presentes en la muestra | Los efectos de los contaminantes se muestran en la página Contaminants. Probar con un método de extracción alternativo que no provoque el arrastre de contaminantes. |
Fluctuación de la temperatura
| Observaciones | Posibles causas | Comentarios y acciones recomendadas |
|---|---|---|
| Fluctuación de la temperatura | La celda de flujo ha perdido contacto con el dispositivo | Comprobar que una almohadilla térmica cubra la placa metálica de la parte posterior de la celda de flujo. Reinsertar la celda de flujo y presionar para asegurarse de que las clavijas del conector estén bien conectadas al dispositivo. Si el problema continúa, contacte con el servicio de asistencia técnica. |
Error al intentar alcanzar la temperatura deseada
| Observaciones | Posibles causas | Comentarios y acciones recomendadas |
|---|---|---|
| MinKNOW muestra el mensaje "Error al intentar alcanzar la temperatura deseada" | El dispositivo ha sido colocado en un lugar con una temperatura ambiente inferior a la media o en un lugar con escasa ventilación (lo que provoca el sobrecalientamiento de las celdas de flujo). | MinKNOW dispone de un tiempo predeterminado para que las celdas de flujo alcancen la temperatura fijada. Una vez transcurrido ese tiempo, aparece un mensaje de error, pero el experimento de secuenciación continúa. Secuenciar a una temperatura incorrecta puede provocar disminuciones en el rendimiento y generar índices de calidad Qscore menores. Corrija la ubicación del dispositivo, procurando que esté a temperatura ambiente y tenga buena ventilación; a continuación, reinicie el proceso en MinKNOW. Encontrará más información sobre el control de temperatura del MinION en este enlace. |
Last updated: 5/26/2026
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