测序芯片清洗剂盒（EXP-WSH004 或 EXP-WSH004） (WFC_9120_v1_revS_25Jul2025)
PromethION: Protocol
测序芯片清洗剂盒（EXP-WSH004 或 EXP-WSH004） V WFC_9120_v1_revS_25Jul2025
仅供研究使用
FOR RESEARCH USE ONLY.
Contents
实验方案简介
测序芯片清洗前的准备
测序芯片清洗
清洗后的操作选项
概览
仅供研究使用
1. 实验方案概览
测序芯片清洗试剂盒简介
测序芯片清洗试剂盒可实现同一张测序芯片上的多轮文库测序。该试剂盒通过冲洗并消化测序芯片中现有的 DNA 文库，同时恢复芯片内的测序环境，为后续文库或新文库上样做好准备。测序芯片清洗试剂盒兼容 R9.4.1 及 R10.4.1芯片。
测序芯片清洗试剂盒也可用于冲洗 RNA 测序芯片，以去除其中的 RNA 文库，但无法清除 RNA 引起的堵孔，也无法恢复纳米孔。
借助测序芯片清洗试剂盒，同一张测序芯片可经清洗后多次复用*，从而充分利用其剩余测序时间。
*测序芯片可清洗并重复使用的次数取决于多种因素，通常为 3 至 6 次。有关测序芯片的重复利用及相关限制因素，详见测序芯片清洗试剂盒（EXP-WSH004 或 EXP-WSH004-XL）专题技术文档。
清洗完成后，您可选择以下任一方式再次使用测序芯片：
- 上样后续文库或新文库，立即开始测序；
- 向测序芯片中加入清洗试剂盒中的储存缓冲液（S），然后将其储存在 2–8°C，供日后使用。
测序芯片清洗剂盒（EXP-WSH004 或 EXP-WSH004）专题技术文档
有关测序芯片清洗试剂盒（EXP-WSH004 或 EXP-WSH004-XL）的工作原理、性能数据及其他建议，详见测序芯片清洗试剂盒（EXP-WSH004 或 EXP-WSH004-XL）专题技术文档。
2. 仪器及耗材
材料
- 测序芯片清洗剂盒（EXP-WSH004）或测序芯片清洗试剂盒 XL（EXP-WSH004-XL）
- 请使用测序试剂盒中提供的测序芯片预处理试剂，或下列试剂盒中的相应试剂：
- 测序辅助扩展包 V14（EXP-AUX003）
- 测序芯片预处理试剂盒（EXP-FLP004）
仪器
- P1000 移液枪和枪头
- P20 移液枪和枪头
- 盛有冰的冰桶
文库上样
清洗测序芯片后重新上样文库时，可能需要额外的缓冲液。所需缓冲液可从以下扩展包中获取：
测序辅助扩展包 V14（EXP-AUX003）。该扩展包包含测序缓冲液（SB）、洗脱缓冲液（EB）、文库溶液（LIS）和文库磁珠（LIB），以及 Kit 14 测序芯片预处理试剂：测序芯片冲洗液（FCF）和测序芯片系绳（FCT）。此扩展包仅与我们的 Kit 14 试剂兼容。
测序芯片预处理试剂盒（EXP-FLP004）。该扩展包包含以下两种 Kit 14 测序芯片预处理试剂：测序芯片冲洗液（FCF）和测序芯片系绳（FCT）。此扩展包仅与 Kit 14 试剂兼容。
测序芯片清洗试剂盒(EXP-WSH004)内容物
- 清洗混合液（WMX）中含有核酸酶 I；
- 清洗稀释液（DIL）中的核酸外切酶缓冲液可维持核酸酶 I 的最大活性；
- 储存缓冲液（S）用于保存测序芯片，以供后续使用。
测序芯片清洗试剂盒-XL（EXP-WSH004-XL）内容物
- 清洗混合液（WMX）中含有核酸酶 I；
- 清洗稀释液（DIL）中的核酸外切酶缓冲液可维持核酸酶 I 的最大活性；
- 储存缓冲液（S）用于保存测序芯片，以供后续使用。
3. 操作注意事项及 PromethION 测序芯片组件说明
在整个清洗过程中，请勿将测序芯片从测序设备中取出。
我们强烈建议在整个清洗过程中将测序芯片留在测序设备中，以避免芯片移动，并保持温度稳定。
测序芯片清洗期间的遮光片处理
清洗过程中，遮光片可保留在测序芯片上。如需观察芯片阵列，也可将其取下。
请务必遵循本实验指南中的说明，并在 恢复测序或开展下一次测序前，将遮光片重新安装到测序芯片上。
熟悉 PromethION 测序芯片各组件的位置和功能。
如有需要，回收测序芯片中的文库。
如您计划在清洗测序芯片前回收当前的测序文库，请务必先完成文库回收，再进行后续操作。
文库回收方法详见从测序芯片中回收文库实验指南。
观看 PromethION 测序芯片清洗及重新上样演示视频。
该视频将演示如何在测序结束后清洗测序芯片并上样新文库。我们强烈建议所有用户在进行此操作前观看演示视频。
视频：PromethION 测序芯片的清洗及再次上样
4. 准备测序芯片清洗试剂盒中的试剂
材料
- 测序芯片清洗剂盒（EXP-WSH004）或测序芯片清洗试剂盒 XL（EXP-WSH004-XL）
耗材
- 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind 离心管
仪器
- P1000 移液枪和枪头
- P20 移液枪和枪头
- 涡旋混匀仪
- 迷你离心机
- 盛有冰的冰桶
我们强烈建议测序芯片清洗试剂现用现配。
请勿将配制后的测序芯片清洗混合液存放超过 1 天，否则可能影响清洗效果。
将清洗混合液（WMX）置于冰上。请勿涡旋振荡该试剂。
于室温下解冻一管清洗稀释液（DIL）。
涡旋振荡混匀清洗稀释液（DIL），瞬时离心，置于冰上。
在一支洁净的1.5ml Eppendorf DNA LoBind离心管内，按下表制备测序芯片清洗混合液：
| 试剂 | 每张测序芯片所需体积 |
|---|---|
| 清洗混合液（WMX） | 2 μl |
| 清洗稀释液（DIL） | 398 μl |
| 总体积 | 400 μl |
吹打混匀，然后将离心管置于冰上。
请注意： 请勿涡旋振荡测序芯片清洗混合液。
配制完成后，请将测序芯片清洗混合液置于冰上备用。
5. 暂停或停止测序，吸除废液
仪器
- P1000 移液枪和枪头
整个清洗过程中，请勿将测序芯片从测序设备中取出。
我们强烈建议在整个清洗过程中将测序芯片留在测序设备中，以避免芯片移动，减少组件损坏和操作失误，并最大限度保持测序芯片性能。
在 MinKNOW 中停止或暂停测序实验
进行任何清洗操作前，请确保测序芯片未在测序。测序期间操作芯片可能会导致芯片损坏或纳米孔损失。
请确保测序芯片的加液孔均处于关闭状态。
请注意： 在吸出废液前，请确保加液孔已关闭，以避免气泡进入传感器阵列，造成大量测序通道损失。
使用 P1000 移液枪，将废液通过废液孔吸出。
应吸除废液槽中的全部废液。如一次无法吸除全部废液，可先排空移液枪，再重复吸取，直至废液槽内无液体残留。
1.将 P1000 移液枪转至 1000µl 刻度。
2.将 P1000 枪头垂直插入废液孔中。
3.从该废液孔中缓缓吸除废液。
请注意： 由于加液孔已关闭，因此传感器阵列内的液体不会流失。
随后，进入测序芯片清洗环节。
6. 清洗测序芯片
材料
- 上一节配制的测序芯片清洗混合液
仪器
- P1000 移液枪和枪头
- P200 移液枪和枪头
- 盛有冰的冰桶
顺时针转动加液孔孔盖，使加液孔显露出来。
小心地从测序芯片中反旋吸出缓冲液。请勿吸出超过 20-30 µl的缓冲液，并确保芯片上的纳米孔阵列一直有缓冲液覆盖。将气泡引入阵列会对纳米孔造成不可逆转地损害。
将加液孔打开后，检查孔周围是否有小气泡。请按照以下方法，从孔中吸出少量液体以清除气泡：
1.将 P1000 移液枪转至 200µl 刻度。
2.将枪头垂直插入测序芯片加液孔中。
3.反向转动移液枪量程调节转纽，直至移液枪刻度在220-230 µl之间，或直至您看到有少量缓冲液进入移液枪枪头。
4.肉眼检查，确保从测序芯片加液孔到传感器阵列的缓冲液连续且无气泡。
取 200 μl 配置好的测序芯片清洗混合液，并按以下步骤缓缓加入测序芯片的加液孔：
1.使用 P1000 移液枪吸取 200 µl 测序芯片清洗混合液。
2.将移液枪枪头插入加液孔，请确保枪尖没有气泡。
3.缓慢转动移液枪量程调节转钮（若移液枪具备该功能），使测序芯片清洗混合液缓慢进入测序芯片；或 非常缓慢地 按压移液枪按钮，直至枪尖内剩余少量缓冲液。
请注意： 向测序芯片中加入测序芯片清洗混合液时，整个过程应持续 至少 5 秒，并确保缓慢、匀速加液。
将测序芯片清洗混合液加入测序芯片后，计时孵育 5 分钟。
孵育结束后，重复步骤 3，再次加入 200 µl 配制好的测序芯片清洗混合液。
合上加液孔并等待1小时。
使用 P1000 移液枪，将废液通过废液孔吸出。
测序芯片现已清洗完毕，可继续执行下一步操作。
请执行以下操作之一：
- 选项 1：在该测序芯片上进行第二轮文库测序
- 选项 2：储存测序芯片，以备后用
请注意： 请勿在测序芯片阵列上留有清洗混合液的情况下储存测序芯片，否则可能导致纳米孔永久性损失。
7. 选项 1：在清洗过的测序芯片上进行第二轮文库测序
材料
- 请使用测序试剂盒中提供的测序芯片预处理试剂，或下列试剂盒中的相应试剂：
- 测序辅助扩展包 V14（EXP-AUX003）
- 测序芯片预处理试剂盒 V14（EXP-FLP004）
仪器
- P1000 移液枪和枪头
- P20 移液枪和枪头
- 盛有冰的冰桶
本方法中列出的测序试剂均基于最新的 V14 试剂体系。
如您使用早期版本的试剂体系，或试剂盒要求使用特定的测序试剂，请根据实际应用选择相应的测序试剂。
本节所用的缓冲液不支持测序芯片质检，因此无法在下一次文库上样前确认可用纳米孔的数量。不过，开始测序后，首次孔扫描会报告可用孔数量。
于室温下解冻测序缓冲液（SB）、文库颗粒（LIB）或文库溶液（LIS）、测序芯片系绳（FCT）和测序芯片冲洗液（FCF）。完全解冻后，涡旋振荡混匀。然后瞬时离心，置于冰上。
混合下表所列试剂，并充分吹打混匀，制备含 BSA 的测序芯片预处理液。
| 试剂 | 体积（每张芯片） |
|---|---|
| 测序芯片冲洗液 (FCF) | 1170 µl |
| 测序芯片系绳（FCT） | 30 µl |
| 总体积 | 1200 µl |
顺时针滑动加液孔孔盖，将其打开。
将加液孔打开后，检查孔周围是否有小气泡。请按照以下方法，从孔中吸出少量液体以清除气泡：
1.将 P1000 移液枪转至 200µl 刻度。
2.将枪头垂直插入加液孔中。
3.反向旋转移液枪的量程调节旋钮，直至刻度显示 220–230 µl，以回吸 20–30 µl 液体；或直至您看到有少量缓冲液进入移液枪枪头。
注意： 从测序芯片中回吸缓冲液时请小心操作，回吸量不得超过 20–30 µl。肉眼检查，确保从加液孔到传感器阵列的缓冲液连续且无气泡。
吸取 500 µl 预处理液，并按以下步骤缓缓加入测序芯片加液孔：
1.使用 P1000 移液枪吸取 500μl 预处理液。
2.将移液枪枪头插入加液孔，请确保枪尖没有气泡。
3.缓慢转动移液枪量程调节转钮（若移液枪具备该功能），使预处理液缓慢进入测序芯片；或参考演示视频， 非常缓慢地 按压移液枪按钮，直至枪尖内剩余少量缓冲液。
请注意： 向测序芯片中加入 500 µl 预处理液时，整个过程应持续至少 5 秒，并确保缓慢、匀速。
为充分清除酸酶，两次预处理液冲洗之间须间隔 5 分钟。
合上加液孔并等待 5 分钟。
在此期间，请按照以下步骤准备用于上样的文库。
将含有文库颗粒的 LIB 管用移液枪吹打混匀。
LIB 管内的文库颗粒分散于悬浮液中。由于颗粒沉降速度非常快，因此请在混匀颗粒后立即使用。
对于大多数测序实验，我们建议您使用文库颗粒（LIB）。但如文库较为粘稠，您可考虑使用文库溶液（LIS）。
另取一支洁净的离心管，按照相应实验指南中“PromethION 测序芯片的预处理和上样”章节制备待上样文库，以确保所用试剂及其体积符合要求。
| 试剂 | 每张测序芯片所需体积 |
|---|---|
| 测序缓冲液（SB） | 100 µl |
| 文库颗粒 (LIB)，临用前充分混匀；或文库溶液 (LIS) | 68 µl |
| DNA 文库 | 32 µl |
| 总体积 | 200 µl |
使用 P1000 移液枪，将废液通过废液孔吸出。
应吸除废液槽中的全部废液。如一次无法吸除全部废液，可先排空移液枪，再重复吸取，直至废液槽内无液体残留。
1.将 P1000 移液枪转至 1000µl 刻度。
2.将 P1000 枪头垂直插入废液孔中。
3.从该废液孔中缓缓吸除废液。
请注意： 由于加液孔已关闭，因此传感器阵列内的液体不会流失。
按照以下步骤，缓慢向加液孔中再次加入 500 µl 预处理液：
1.打开加液孔孔盖。
2.使用 P1000 移液枪吸取 500μl 预处理液。
3.将移液枪枪头插入加液孔，请确保枪尖没有气泡。
4.缓慢转动移液枪量程调节转钮（若移液枪具备该功能），使预处理液缓慢进入测序芯片；或参考演示视频， 非常缓慢地 按压移液枪按钮，直至枪尖内剩余少量缓冲液。
请注意： 向测序芯片中加入 500 µl 预处理液时，整个过程应持续至少 5 秒，并确保缓慢、匀速。
临上样前，用移液枪轻轻吹打混匀制备好的测序文库。
使用 P1000 移液枪向加液孔中加入 200 µl 文库。
缓慢转动移液枪的量程调节齿轮（若移液枪具备该功能），将测序文库加入测序芯片；或 非常缓慢地 按压移液枪按钮。
请注意： 向测序芯片中加入 200 µl 测序文库时，整个过程应持续至少 5 秒，并确保缓慢、匀速。
合上加液孔孔盖。
为获得最佳测序产出，在文库样本上样后，请立即为测序芯片安装遮光片。
建议在文库上样后始终保留测序芯片遮光片，包括测序芯片清洗及重新上样期间。待文库从测序芯片中吸出后，即可取下遮光片。
如遮光片不在测序芯片上，请您按照以下步骤安装：
1.将遮光片的中空部分（空槽）与测序芯片的加液孔孔盖对齐。确保遮光片的前沿位于测序芯片ID的上方。
2.用力下压遮光片的卡垫部分，遮光片空槽边缘会随卡垫卡入加液孔孔盖下方。
准备就绪后，合上 PromethION 设备上盖。
请在为 PromethION 芯片上样后，等待10分钟再启动实验，以提高芯片产出。
文库保存建议
若为 短期 保存或重复使用（例如在清洗芯片后再次上样），我们建议将文库置于Eppendorf LoBind 离心管中 4℃ 保存。 若为一次性使用且储存时长 超过3个月 ，我们建议将文库置于Eppendorf LoBind 离心管中 -80℃ 保存。 更多有关信息，请参阅DNA文库稳定性专题技术文档。
8. 选项 2：储存测序芯片，以备后用
材料
- 测序芯片清洗剂盒（EXP-WSH004）或测序芯片清洗试剂盒 XL（EXP-WSH004-XL）
仪器
- P1000 移液枪和枪头
- P20 移液枪和枪头
储存缓冲液（S）可用于冲洗并储存测序芯片，以供日后使用；也可用于在下一次文库上样前进行芯片质检，确认可用纳米孔的数量。
于室温下解冻一管储存缓冲液（S）。
顺时针转动加液孔孔盖，使加液孔显露出来。
将加液孔打开后，检查孔周围是否有小气泡。请按照以下方法，从孔中吸出少量液体以清除气泡：
1.将 P1000 移液枪转至 200µl 刻度。
2.将枪头垂直插入加液孔中。
3.反向旋转移液枪的量程调节旋钮，直至刻度显示 220–230 µl，以回吸 20–30 µl 液体；或直至您看到有少量缓冲液进入移液枪枪头。
注意： 从测序芯片中回吸缓冲液时请小心操作，回吸量不得超过 20–30 µl。肉眼检查，确保从加液孔到传感器阵列的缓冲液连续且无气泡。
吸取 500 µl 储存缓冲液（S），并按以下步骤缓缓加入测序芯片加液孔：
1.使用 P1000 移液枪吸取 500μl 储存缓冲液（S）。
2.将移液枪枪头插入加液孔，请确保枪尖没有气泡。
3.缓慢转动移液枪量程调节转钮（若移液枪具备该功能），使储存缓冲液缓慢进入测序芯片；或 非常缓慢地 按压移液枪按钮，直至枪尖内剩余少量缓冲液。
请注意： 向测序芯片中加入储存缓冲液（S）时，整个过程应持续 至少 5 秒，并确保缓慢、匀速加液。
使用 P1000 移液枪，将废液通过废液孔吸出。
应吸除废液槽中的全部废液。如一次无法吸除全部废液，可先排空移液枪，再重复吸取，直至废液槽内无液体残留。
1.合上加液孔孔盖。
2.将 P1000 移液枪转至 1000µl 刻度。
3.将 P1000 枪头垂直插入废液孔中。
4.从该废液孔中缓缓吸除废液。
请注意： 由于加液孔已关闭，因此传感器阵列内的液体不会流失。
现可将测序芯片于2-8℃保存。
当需要再次使用测序芯片时，请将其从储存环境中取出，并在室温下放置约 5 分钟，使其恢复至室温。
我们建议您对清洗或储存后的测序芯片运行测序芯片质检，以确认可用纳米孔的数量。
将内含储存缓冲液（S）的测序芯片插入测序设备，并启动“测序芯片质检”，以确认活性孔数量。更多信息，请参阅 MinKNOW 实验指南中的测序芯片质检 一节。
质检结束后，依次进行测序芯片预处理和文库上样，然后开始下一次测序。
Last updated: 9/30/2026
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