Este protocolo ofrece un flujo de trabajo completo con el que analizar genes famacogenómicos mediante muestreo adaptativo y la plataforma de Oxford Nanopore.

La secuenciación se lleva a cabo durante 72 horas, lo que garantiza una cobertura adecuada de las regiones objetivo. Con el fin de mantener el rendimiento y la capacidad de procesamiento, se programan dos ciclos de lavado y recarga de las celdas de flujo cada 24 horas, lo que resulta en tres cargas durante el experimento.

Pasos del flujo de trabajo:

La tabla siguiente describe los pasos necesarios, incluidos la duración del procesamiento de cuatro muestras y las paradas.

Etapa	Proceso	Duración	Parada opcional
Preparación de muestras	Extraer ADNg de la muestra y cuantificarlo. Fragmentar el ADNg y cuantificarlo.	De 3 a 4 horas	En este punto, es posible guardar el ADNg extraído o fragmentado a –20 °C y utilizarlo más adelante.
Preparación de la biblioteca	Reparar el ADN fragmentado y preparar los extremos de ADN antes de la ligación de los códigos de barras. Ligación directa de los códigos de barras a los extremos de ADN. Ligación de los adaptadores a los extremos de ADN.	35 minutos 60 minutos 50 minutos	4 °C hasta el día siguiente 4 °C hasta el día siguiente 4 °C en almacenamiento a corto plazo o durante un uso repetido, como la recarga de la celda de flujo. A –80 °C en caso de uso único o de almacenamiento a largo plazo. Recomendamos secuenciar la biblioteca tan pronto como se liguen los adaptadores.
Secuenciación	Acondicionar la celda de flujo y cargar la biblioteca. Lavar y volver a cargar la celda de flujo (×2).	~10 min por celda de flujo 60 minutos (×2)

Preparación del experimento

Pasos:

• Disponer de los consumibles, incluidos los reactivos de otros fabricantes, los kits y el equipo necesarios para realizar la extracción de ADN, la fragmentación, la selección de tamaño (en muestras de saliva) y la secuenciación.
• Descargar el programa que obtendrá y analizará los datos.
• Comprobar que la celda de flujo tenga suficientes poros para realizar una buena secuenciación.

Preparación de muestras

Pasos:

• Con ayuda de los protocolos recomendados, extraer ADN genómico a partir de sangre, cultivos celulares o saliva y fragmentarlo. Si procede, realizar la selección de tamaño con microesferas.

Este protocolo es compatible con la extracción de ADN genómico de los siguientes materiales biológicos, mediante los kits recomendados:

Tipo de muestra	Kit de extracción
Sangre	Puregene Blood Kit (Qiagen, 158023)
Cultivos celulares	Puregene Cell Kit (Qiagen, 158043)
Saliva	GeneFix™ Saliva-Prep 2 DNA Isolation Kit (Isohelix, GSPN)

• Comprobar la cantidad, pureza y longitud del material extraído. Los controles de calidad llevados a cabo durante la preparación de muestras son fundamentales y garantizan el éxito del experimento.

Preparación de la biblioteca

Es necesario utilizar el kit de ligación directa Native Barcoding Kit 24 V14 (SQK-NBD114.24), que incluye los siguientes pasos:

• Reparación del ADN y preparación de los extremos
• Ligación directa de los códigos de barras (sin PCR)
• Ligación de los adaptadores y purificación

Secuenciación y análisis

Pasos:

• Empezar el proceso de secuenciación con el programa MinKNOW™, que recopilará los datos sin procesar del dispositivo y los convertirá en lecturas de bases identificadas.
• Analizar los datos con el flujo de trabajo wf-pgx de EPI2ME.

Configuración del paquete de datos y del flujo de trabajo wf-pgx:

Tras el registro, recibirá un paquete de datos con los archivos necesarios al inicio de la secuenciación y durante el análisis del experimento, que incorpora una configuración específica de wf-pgx, lo que garantiza la uniformidad de los parámetros y la compatibilidad entre todas las muestras. Las instrucciones de instalación del archivo 2ME de EPI2ME, incluidas las indicaciones para probarlo con datos de demostración, se encuentran en la sección Análisis de datos de este protocolo.

Contenido del paquete:

• Archivo 2ME – contiene la definición del flujo de trabajo wf-pgx, que se utiliza con la aplicación EPI2ME.
• Archivo del genoma de referencia – proporcionado en formato FASTA.
• Archivo BED de muestreo adaptativo – utilizado en el enriquecimiento de regiones objetivo asociadas a la farmacogenómica.
• Hoja de muestras de ejemplo: sirve para asociar cada código de barras con la muestra correspondiente.

ADN de partida

En este flujo de trabajo, recomendamos extraer ADN genómico con los kits recomendados a partir de 2 ml de saliva, 1 ml de sangre o 5×10⁶ de células procedentes de líneas celulares.

Hay otros kits de extracción disponibles, pero Oxford Nanopore no los ha probado.

En la preparación de la biblioteca, necesitará 2 µg de ADNg fragmentado de cada muestra. Los fragmentos por debajo de 3 kb deben representar menos del 10 % del total de ADN. La presencia excesiva de fragmentos cortos compromete el éxito del flujo de trabajo. Si supera el 10 %, debe realizarse una selección de tamaño con microesferas tal como se describe más adelante.

Reactivos de otros fabricantes

Hemos probado y recomendamos el uso de todos los reactivos de otros fabricantes usados en este protocolo. Oxford Nanopore no ha evaluado otras alternativas. Preparar estos reactivos siguiendo las instrucciones del fabricante.

Verificar la celda de flujo

Recomendamos encarecidamente comprobar el número de poros presente en la celda de flujo antes de iniciar un experimento de secuenciación, en un plazo de 12 semanas desde la compra de las celdas de flujo PromethION. Oxford Nanopore sustituirá cualquier celda de flujo no utilizada, con un número de poros inferior al indicado en la tabla siguiente, siempre y cuando el resultado se notifique dentro de los dos días siguientes a la comprobación y se hayan seguido las instrucciones de almacenamiento. Las instrucciones de comprobación de la celda de flujo se encuentran en el documento Flow Cell Check.

Celdas de flujo	Cantidad mínima de poros activos cubierta por la garantía
PromethION	5 000

Este protocolo admite tres tipos de muestras en la extracción de ADN genómico: sangre, cultivos celulares y saliva. Cada tipo de muestra requiere un método de extracción específico, que garantice un rendimiento y calidad del ADN óptimos. Siga el procedimiento de extracción adecuado a la sustancia de partida elegida.

Tras la extracción, el ADN genómico de cada tipo de muestra debe fragmentarse mecánicamente en fragmentos de aproximadamente 10 kb con un tubo g-TUBE de Covaris. Las muestras de saliva se someten a un procedimiento específico de fragmentación y purificación, que incluye una etapa de selección de tamaño, antes de pasar a la preparación de la biblioteca. La sangre y los cultivos celulares siguen el protocolo estándar de extracción y fragmentación, tras el cual el ADN fragmentado pasa directamente a la fase de preparación de bibliotecas.

Descripción general:

1. Extraer el ADN mediante el kit Isohelix.
2. Fragmentar el ADN con el tubo g-TUBE de Covaris.
3. Realizar una selección de tamaño mediante microesferas de la muestra fragmentada y verificar su cantidad, pureza y longitud.

La fragmentación del ADN genómico (ADNg) durante la preparación de la biblioteca se lleva a cabo mediante un tubo g-TUBE (Covaris), que corta el ADN en fragmentos de aproximadamente 10 kb.

A fin de obtener material óptimo que facilite la secuenciación de ADN a partir de muestras de saliva, se debe realizar una selección de tamaño.

Esta sección proporciona instrucciones sobre la extracción de ADN a partir de sangre humana en EDTA K2 mediante el kit Puregene Blood de Qiagen.

La fragmentación del ADN genómico (ADNg) durante la preparación de la biblioteca se lleva a cabo mediante un tubo g-TUBE (Covaris), que corta el ADN en fragmentos de aproximadamente 10 kb.

En este método, la celda de flujo se lava tras aproximadamente 24 h de secuenciación, lo que ayuda a desobstruir los poros y garantiza una adquisición de datos eficaz. Transcurridas otras 24 h, la celda de flujo se vuelve a lavar y se recarga por segunda vez. Por eso, en la sección de ligación del adaptador se preparó suficiente biblioteca para 3 cargas.

• Este método de lavado tiene por objeto eliminar la mayor parte de la biblioteca inicial y desobstruir los poros como preparación de la celda de flujo antes de cargar la biblioteca siguiente.
• La adquisición de datos en MinKNOW debe interrumpirse durante el lavado y la carga de la biblioteca.
• Una vez lavada la celda de flujo, es posible cargar la siguiente biblioteca.

A continuación se presentan datos de ejemplo sobre el estado de los poros observado en una celda de flujo antes y después de realizar los lavados. Además, es posible observar un ejemplo de los datos de secuenciación acumulados, en el que los asteriscos rojos indican los lavados y recargas realizados.

Figura 1. Estado de los canales durante una secuenciación de 96 horas. Los lavados de la celda de flujo se incluyen en el método con el fin de desobstruir los poros y facilitar la adquisición continua de datos. Los asteriscos rojos indican cuándo se realizó cada purgado.

En él se muestra cómo lavar una celda de flujo al finalizar una secuenciación y cargar una biblioteca nueva.

Una vez cargada la celda de flujo, es posible iniciar el experimento de secuenciación en MinKNOW.

Al principio de un experimento, MinKNOW ofrece dos opciones:

• Iniciarlo sin hoja de muestras, en cuyo caso los archivos de salida se nombran con identificadores de código de barras predeterminados (por ejemplo, barcode01, barcode02).
• Iniciarlo utilizando una hoja de muestras, lo que permite asignar identificadores personalizados a cada código de barras, que se utilizarán en los nombres de los archivos de salida, lo que mejora la trazabilidad. A continuación, se describen los pasos de ambos métodos.

1. Ir a la página principal y pulsar Iniciar secuenciación.

2. Escribir el nombre del experimento, el ID de las muestras y elegir el tipo de celda de flujo en el menú desplegable.

3. En la selección de kits, elegir Native Barcoding Sequencing Kit 24 (SQK-NBD114.24).

4. Activar la Identificación de bases con el modelo de gran precisión (debería estar actividado por defecto). Activar la Adición de códigos de barras (debería estar activado por defecto con los kits de códigos de barras ). Activar el Muestreo adaptativo.

5. Seleccionar el modo Enriquecer y activar la identificación de bases solo de las lecturas objetivo. Luego utilizar el archivo BED PGx y el genoma de referencia proporcionados en el paquete de datos, que están configurados expresamente con objeto de enriquecer las regiones farmacogenómicas. El uso de otros archivos BED u otros archivos de referencia produce resultados inconsistentes.

6. El archivo de salida debe configurarse en formato BAM y la frecuencia ajustarse a Cada 10 minutos.

7. Mantener el Alineamiento DESACTIVADO.

8. Una vez revisada la configuración, pulsar Iniciar y comenzar la secuenciación.

1. En el menú de inicio, seleccionar Partir de una hoja de muestras.

2. Cuando se inicie un experimento utilizando una hoja de muestras en MinKNOW, hara faltá subir un archivo CSV que las defina. Dicho archivo debe seguir la estructura descrita en la siguiente tabla. Cada fila corresponde a una sola muestra con código de barras; los encabezados de las columnas, tal como se indica, deben estar en minúsculas.

Al cargarla, MinKNOW realizará comprobaciones automáticas en busca de errores. Si no se detectan errores, pulsar Continuar y pasar a la configuración de la secuenciación.

Título de columna de la hoja de muestras	Descripción
flow_cell_id	Identificador único de la celda de flujo en uso (por ejemplo, SIM72476). Debe coincidir con la configuración del dispositivo.
flow_cell_product_code	Código de producto de la celda de flujo (por ejemplo, FLO-PRO114M).
kit	Nombre del kit de preparación de la biblioteca utilizado (por ejemplo, SQK-NBD114-24).
sample_id	Nombre o identificador de la muestra o conjunto (por ejemplo, pgx_1).
experiment_id	Nombre del experimento o identificador con fines de agrupación o seguimiento.
código de barras	Código de barras asociado a la muestra (p. ej., barcode01). Debe coincidir con el kit de adición de códigos de barras.
alias	Nombre definido por el usuario que se usa en lugar del ID del código de barras en los archivos de salida (por ejemplo, test1). Debe tener entre 1 y 40 caracteres y contener solo letras, números, guiones o guiones bajos. Existen nombres reservados —unclassified, classified y mixed— que no pueden utilizarse por motivos de compatibilidad; no obstante, sus traducciones al español no generan conflicto.

3. Cuando la hoja de muestras se haya validado y aceptado, avanzar a la pantalla Configuración del experimento como se muestra a continuación.

4. Activar la Identificación de bases con el modelo de Gran precisión (debería estar actividada por defecto). Activar la Adición de códigos de barras (debería estar activada por defecto con los kits de códigos de barras). Activar el Muestreo adaptativo.

5. Seleccionar el modo Enriquecer y activar la identificación de bases solo en las lecturas objetivo. Luego, utilizar el archivo BED PGx y el genoma de referencia proporcionados en el paquete de datos, que están configurados expresamente con el fin de enriquecer las regiones farmacogenómicas. El uso de otros archivos BED u otros archivos de referencia produce resultados inconsistentes.

6. El archivo de salida debe configurarse en formato BAM y la frecuencia ajustarse a Cada 10 minutos.

7. Mantener el Alineamiento DESACTIVADO.

8. Una vez revisada la configuración, pulsar Iniciar y comenzar la secuenciación.

Los dispositivos PromethION 24/48 y PromethION 2 Integrated (P2i), incluido el PromethION 2 Solo conectado a un GridION, son compatibles con los requisitos informáticos del análisis.

Si ejecuta este análisis desde un dispositivo de secuenciación integrado (p.ej., PromethION 24/48 o P2i), no lo haga mientras la secuenciación esté en curso, ya que el análisis interfiere con los experimentos activos.

Por otro lado, si realiza el análisis en un ordenador destinado a este fin y no en un dispositivo de Oxford Nanopore, es necesario que reúna las siguientes características.

	Mínimo	Recomendado
Número de núcleos de CPU	8	16
Memoria	32 GB	64 GB
Sistema operativo	Linux/Windows/macOS	Linux/Windows/macOS
Almacenamiento recomendado	500 GB	500 GB

EPI2ME Desktop

Este análisis requiere la aplicación de escritorio EPI2ME (versión 5.2.5 o posterior), que se descarga en (https://epi2me.nanoporetech.com/downloads/). La instalación varía en función del sistema operativo. Consulte las instrucciones de instalación.

1. Cuando la aplicación de escritorio EPI2ME esté instalada, en el panel principal, pulsar Settings y configurar la carpeta de trabajo como /data/epi2melabs, tal como se muestra a continuación, lo que garantizará que los archivos generados por el flujo de trabajo durante el análisis no llenen la carpeta personal del usuario.

El flujo de análisis bioinformático se distribuye como un archivo 2ME, que incluye todas las imágenes de Docker y el genoma de referencia necesarios durante la ejecución.

2. La instalación del flujo bioinformático se inicia en el menú Launch.

3. Seleccionar la opción Import workflow.

4. Pulsar en el icono de la carpeta, seleccionar el archivo 2ME y pulsar Install.

A modo de comprobación, recomendamos realizar un análisis de demostración. Es necesario tener acceso a internet a fin de descargar dos archivos BAM pequeños, tras lo cual la herramienta descargará los datos automáticamente y ejecutará el flujo bioinformático.

5. Iniciar la demostración, seleccionando Opciones y en el menú desplegable, Ejecutar análisis de demostración.

6. Un icono verde con la etiqueta Completado indica que la ejecución se ha realizado correctamente.

wf-pgx utiliza como entrada una carpeta que contiene una subcarpeta por muestra con archivos BAM o FASTQ. Un dato importante: el nombre de la carpeta se utilizará como nombre de la muestra, ya sea directamente o mediante un archivo CSV donde se le asigne un alias.

Los archivos BAM de entrada no tienen porqué estar alineados, en cuyo caso wf-pgx los alineará. Si los archivos BAM se alinean con un genoma de referencia distinto al proporcionado como parte del paquete de datos, wf-pgx realineará las secuencias.

1. Iniciar el flujo bioinformático seleccionándolo en el menú Launch.

2. A continuación, pulsar en la pestaña azul Launch.

3. Los datos se proporcionan en la opción Bam, a la que se accede desde la carpeta que contiene las carpetas con los datos de todas las muestras.

4. Seleccionar el Método de enriquecimiento utilizado al generar los datos: Muestreo adaptativo (AS).

5. Pulsar en Launch workflow. Por defecto, limita el análisis a las regiones especificadas en el archivo BED de PGx proporcionado.

6. El flujo de trabajo indicará el estado del análisis a medida que avance. Una vez finalizado, un icono verde indicará que ha Terminado, tal como se muestra a continuación. Parte del resultado estará disponible solo cuando el flujo de trabajo haya finalizado.

Finalizado el análisis, es posible consultar un resumen del experimento en la sección Informes.

El informe incluye siete secciones, descritas brevemente a continuación.

1. Metadatos de la muestra - indica la correspondencia entre el nombre de la muestra y el código de barras asociado. Los datos de cada muestra se encuentran en su pestaña correspondiente.

2. Estadísticas de posiciones genotipadas - resumen de SNPs e indels encontrados en las regiones objetivo. El número de registros corresponde al total de pares de bases genotipados. Las posiciones sin alelos alternativos (ALT) corresponden a posiciones genotipadas en las que no se detectan variantes.

3. Chinook - Tabla de diplotipos de CYP2D6 identificados por muestra mediante Chinook, la herramienta de identificación de variantes de Oxford Nanopore.

4. Cobertura de PharmCAT - resumen de la cobertura en posiciones relevantes de PharmCAT implicadas en la asignación de alelos estrella. También incluye una subsección donde se analizan en detalle las posiciones específicas de cada muestra.

Esta sección también explora las posiciones con una cobertura inferior a 30X.

5. Versiones de programas - versiones de las herramientas utilizadas en el análisis.

6. Parámetros del flujo de trabajo - opciones definidas por el usuario o establecidas como predeterminadas durante este análisis.

7. Acerca de este informe - aviso sobre el uso de este informe y de la versión del flujo bioinformático wf-pgx utilizado.

Los archivos resultantes del análisis están disponibles en la pestaña Archivos.

También es posible acceder a los archivos resultantes en el gestor de archivos local seleccionando Options y, a continuación, Open folder.

Archivos generados por el flujo de trabajo:

Archivos	Descripción
software_versions.txt	Enumera las versiones de las principales aplicaciones informáticas que se utilizan durante la ejecución del flujo bioinformático. Resulta útil en la depuración y la reproducibilidad.
wf-pgx-report.html	Informe resumen en HTML que incluye estadísticas de secuenciación.
sample/	Carpeta que contiene los resultados específicos de la muestra, incluídas la identificación de variantes, las predicciones de farmacogenómica y los archivos de análisis intermedios.
sample/sample.filtered.vcf.gz	Archivo VCF comprimido con la identificación de variantes filtradas de esta muestra. Contiene las variantes relevantes tras aplicar los filtros de profundidad y frecuencia alélica.
sample/sample.filtered.vcf.gz.tbi	Índice del VCF filtrado, utilizado por herramientas como bcftools o IGV en consultas rápidas.
muestra/muestra.haplotagged.bam	Archivo BAM en el que cada lectura está asociada a un haplotipo inferido, que incluye tanto el contenido de tagged.bam, generado por Chinook, como el resto del genoma. Útil en el análisis y visualización posterior, que tienen en cuenta la fase.
sample/sample.haplotagged.bam.bai	Índice de sample.haplotagged.bam.
sample/sample.match.json	Archivo JSON con los resultados de asignación de alelos de PharmCAT.
sample/sample.pharmcat.tsv	Archivo tabulado que resume los resultados de PharmCAT, incluidos diplotipos, haplotipos e información pertinente de variantes, sin fenotipos ni recomendaciones.
sample/pharmcat.log	Registros de PharmCAT que documentan la actividad durante la ejecución de wf-pgx.
CYP2D6/	Carpeta con resultados detallados del análisis de Chinook del gen CYP2D6.
CYP2D6/chinook.log	Registros de ejecución de Chinook.
CYP2D6/consensus.fasta	Contiene las secuencias ensambladas de los alelos de los genes CYP2D6 y CYP2D7 que Chinook logró reconstruir.
CYP2D6/diplotype_structure.out	Estructura del diplotipo de CYP2D6 inferido a patir de los alelos reconstruidos en consensus.fasta. Las repeticiones en tándem se indican con '+'.
CYP2D6/report.tsv	Archivo tabulado con el informe del diplotipo CYP2D6.
CYP2D6/summary.out	Contiene el diplotipo en formato de alelos estrella (p. ej., *1/*68+*4), conforme a los estándares de PharmVar.
CYP2D6/tagged.bam	Archivo BAM con las lecturas conservadas de la región CYP2D6/CYP2D7, que incluye etiquetas de asignación de alelos («XA») y «sv» en lecturas que apoyan la presencia de copias en tándem.
CYP2D6/tagged.bam.bai	Índice de tagged.bam.
execution/	Carpeta interna de Nextflow con informes del flujo de trabajo y metadatos de ejecución.
execution/report.html	Informe de ejecución de Nextflow que resume el tiempo de ejecución de los procesos, el uso de recursos y el almacenamiento en caché.
execution/timeline.html	Vista cronológica de la ejecución del flujo bioinformático que muestra cuándo se ejecutó cada proceso. Útil en el análisis de cuellos de botella.
execution/trace.txt	Registro detallado de todos los procesos de Nextflow, incluidas la hora de inicio y de finalización, los recursos utilizados y los directorios de trabajo.
igv.json	Archivo JSON utilizado en la configuración de IGV, destinado a visualizar alineamientos y variantes relacionados con la(s) muestra(s).
params.json	Recoge los parámetros de ejecución utilizados en el flujo bioinformático, necesarios en la reproducción del análisis.

Debido a la prolongada duración de la secuenciación, así como a los múltiples lavados de las celdas de flujo y a las repetidas recargas de las bibliotecas, no recomendamos reutilizar las celdas de flujo.

Reutilizarlas en experimentos posteriores provoca que se generen datos insuficientes, lo que dificulta su análisis.

También disponemos de una sección de preguntas frecuentes (FAQ) en la sección Support de la comunidad Nanopore.

Si ha probado las soluciones propuestas y los problemas aún persisten, póngase en contacto con el departamento de Asistencia técnica, bien por correo electrónico (support@nanoporetech.com) o a través del chat de la comunidad Nanopore.

Observaciones	Posibles causas	Comentarios y acciones recomendadas
Baja pureza de ADN (según la lectura con Nanodrop, el ADN presenta una OD 260/280 < 1,8 y una OD 260/230 < 2,0–2,2).	El método de extracción de ADN no proporciona la pureza necesaria.	Los efectos de los contaminantes se muestran en la página Contaminants. Probar con otro método de extracción que no provoque el arrastre de contaminantes. Considere realizar un paso adicional de limpieza SPRI.

Observaciones	Posibles causas	Comentarios y acciones recomendadas
Escasa recuperación	Pérdida de ADN debido a una proporción de microesferas AMPure por muestra inferior a lo previsto.	1. Las microesferas AMPure precipitan con rapidez; antes de añadirlas a la muestra deben estar bien resuspendidas. 2. Si la proporción de microesferas por muestra es inferior a 0.4:1, los fragmentos de ADN, sean del tamaño que sean, se perderán durante la limpieza.
Escasa recuperación	Los fragmentos de ADN son más cortos de lo esperado.	Cuanto menor sea la proporción de microesferas AMPure por muestra, más rigurosa será la selección de fragmentos largos frente a los cortos. Determinar siempre la longitud de la muestra de ADN en un gel de agarosa u otros métodos de electroforesis en gel y a continuación, calcular la cantidad adecuada de microesferas AMPure que se debe utilizar.
Escasa recuperación después de la preparación de los extremos	La fase de lavado utilizó etanol < 70 %.	Si se utiliza etanol < 70 %, el ADN se eluirá de las microesferas. Utilice el porcentaje correcto.

También disponemos de una sección de preguntas frecuentes (FAQ) en la sección Support de la comunidad Nanopore.

Si ha probado las soluciones propuestas y los problemas aún persisten, póngase en contacto con el departamento de Asistencia técnica, bien por correo electrónico (support@nanoporetech.com) o a través del chat de la comunidad Nanopore.

Observaciones	Posibles causas	Comentarios y acciones recomendadas
MinKNOW presentó al inicio de la secuenciación un número de poros inferior al indicado durante la evaluación de la celda de flujo.	Se introdujo una burbuja de aire en la matriz de poros.	Tras comprobar el número de poros presente en la celda de flujo y antes de acondicionarla, es imprescindible quitar las burbujas que haya cerca del puerto de purgado. Si no se quitan, son capaces de desplazarse hacia la matriz de nanoporos y dañar los nanoporos expuestos al aire de manera irreversible. En el vídeo Cómo cargar celdas de flujo PromethION se muestran algunas buenas prácticas con las que evitar que esto ocurra.
MinKNOW presentó al inicio de la secuenciación un número de poros inferior al indicado durante la evaluación de la celda de flujo.	La celda de flujo no está colocada correctamente.	Detener el ciclo de secuenciación, sacar la celda de flujo de la posición e insertarla de nuevo. Comprobar que esté firmemente asentada en el dispositivo y que alcance la temperatura deseada. Si procede, probar a insertarla en una posición diferente.
MinKNOW presentó al inicio de la secuenciación un número de poros inferior al indicado durante la evaluación de la celda de flujo.	La presencia de contaminantes en la biblioteca tal vez haya dañado o bloqueado los poros.	El número de poros resultante tras la evaluación de la celda de flujo se realiza usando el control de calidad (QC) de las moléculas de ADN presentes en el amortiguador de almacenamiento de la celda de flujo. Al inicio de la secuenciación, se utiliza la misma biblioteca a fin de calcular el número de poros activos. Por este motivo, se estima que existe una variabilidad del 10 % en el número de poros detectados. Tener un número de poros considerablemente inferior al inicio de la secuenciación suele estar relacionado con la presencia de contaminantes en la biblioteca que hayan dañado las membranas o bloqueado los poros. Otra manera de mejorar la pureza del material de partida es utilizar otros métodos de extracción o purificación de ADN. Los efectos de los contaminantes se muestran en la página Contaminants. Probar con un método de extracción diferente que no provoque el arrastre de contaminantes.

Observaciones	Posibles causas	Comentarios y acciones recomendadas
MinKNOW muestra el mensaje "Error en el script".		Reiniciar el ordenador y reiniciar MinKNOW. Si el problema persiste, reúna los archivos de registro de MinKNOW y contacte con el departamento de Asistencia técnica. Si no dispone de otro dispositivo de secuenciación, recomendamos que guarde la celda de flujo cargada a 4 °C y contacte con el servicio de asistencia técnica, que proporcionará instrucciones de almacenamiento adicionales.

Observación	Posibles causas	Comentarios y acciones recomendadas
Ocupación de poros <40 %	No se cargó suficiente biblioteca en la celda de flujo.	Procure cargar la cantidad recomendada de biblioteca de buena calidad, según la preparación de la biblioteca del protocolo correspondiente. Cuantificar la biblioteca antes de cargarla.
Ocupación de poros próxima a 0	En la fase de lavado, después de la ligación del adaptador, se utilizó etanol en lugar de Long Fragment Buffer (LFB) o Short Fragment Buffer (SFB).	El etanol desnaturaliza la proteína motor en los adaptadores de secuenciación. Usar Long Fragment Buffer (LFB) o Short Fragment Buffer (SFB) después de la ligación de los adaptadores.
Ocupación de poros próxima a 0	La celda de flujo no tiene anclaje.	Los anclajes se añaden mientras se acondiciona la celda de flujo (vial FCT) Añadir FCT al vial FCF antes de acondicionar la celda de flujo.

Observaciones	Posibles causas	Comentarios y acciones recomendadas
Longitud de lectura más corta de lo esperado	Fragmentación no deseada de la muestra de ADN	La longitud de lectura refleja la longitud del fragmento de la muestra de ADN. La muestra de ADN tiende a fragmentarse durante la extracción y la preparación de la biblioteca. 1. Consulte la sección de buenas prácticas de extracción en la página Extraction Methods de la comunidad Nanopore. 2. Visualizar la distribución de longitudes de los fragmentos del ADN de partida en un gel de agarosa antes de continuar con la preparación de la biblioteca. En la imagen superior, la muestra 1 contiene un elevado peso molecular, mientras que la muestra 2 se ha fragmentado. 3. Durante la preparación de la biblioteca, evitar pipetear y agitar en vórtex al mezclar los reactivos. Dar suaves golpecitos al tubo con el dedo o invertir el vial es suficiente.

Observaciones	Posibles causas	Comentarios y acciones recomendadas
Gran proporción de poros inactivos o no disponibles (se muestran en azul claro en el panel de canales y en el gráfico de actividad de poros). Conforme pasa el tiempo, el gráfico de actividad de poros muestra una proporción creciente de poros "no disponibles".	Hay contaminantes presentes en la muestra.	La función de desbloqueo integrada en MinKNOW elimina algunos contaminantes de los poros; si da resultado, el estado de los poros pasa a "poros en secuenciación". Si la porción de poros no disponibles se mantiene elevada o aumenta: realizar un lavado con nucleasa con el kit Flow Cell Wash (EXP-WSH004)

Observaciones	Posibles causas	Comentarios y acciones recomendadas
Gran proporción de poros inactivos o no disponibles (se muestran en azul claro en el panel de canales y en el gráfico de actividad). Los poros o las membranas se han dañado de manera irreversible).	Se han introducido burbujas de aire en la celda de flujo.	Las burbujas de aire introducidas durante el acondicionamiento de la celda de flujo y la carga de la biblioteca dañan los poros de manera irreversible. La forma más eficaz de evitar que esto ocurra se muestra en el vídeo Cómo cargar celdas de flujo PromethION.
Gran proporción de poros inactivos o no disponibles	Ciertos compuestos copurificados con ADN.	Entre los compuestos conocidos se incluyen los polisacáridos. 1. Purificar con el kit QIAGEN PowerClean Pro. 2. Realizar una amplificación del genoma completo a partir de la muestra original de ADNg con el kit QIAGEN REPLI-g.
Gran proporción de poros inactivos o no disponibles	Hay contaminantes presentes en la muestra.	Los efectos de los contaminantes se muestran en la página Contaminants. Probar con un método de extracción alternativo que no provoque el arrastre de contaminantes.

Observaciones	Posibles causas	Comentarios y acciones recomendadas
Fluctuación de temperatura	La celda de flujo ha perdido contacto con el dispositivo.	Comprobar que una almohadilla térmica cubra la placa metálica de la parte posterior de la celda de flujo. Reinsertar la celda de flujo y presionar hasta que las clavijas del conector estén firmemente en contacto con el dispositivo. Si el problema persiste, contacte con el servicio de Asistencia técnica.

Observaciones	Posibles causas	Comentarios y acciones recomendadas
MinKNOW muestra el mensaje "Error al intentar alcanzar la temperatura deseada".	El dispositivo se colocó en un lugar con una temperatura inferior a la temperatura ambiente habitual o en un lugar con escasa ventilación (lo que provoca el sobrecalientamiento de las celdas de flujo).	MinKNOW tiene un intervalo de tiempo predeterminado dentro del cual las celdas de flujo deben alcanzar la temperatura fijada. Cuando se supera ese tiempo, aparece un mensaje de error, pero el experimento de secuenciación continúa. Secuenciar a una temperatura incorrecta suele provocar una disminución en el rendimiento y generar índices de calidad Q score menores. Corregir la ubicación del dispositivo, procurando que esté a temperatura ambiente y con buena ventilación; a continuación, reiniciar el experimento en MinKNOW.