Oxford Nanopore User Group Meeting, Tokyo
6月1日（月）、東京日本橋にて開催！ オックスフォード・ナノポアテクノロジーズのシーケンシングを活用する国内研究者による魅力的な講演シリーズです。 本セミナーでは、ナノポアチームによる技術・情報アップデートに加え、講演者とのQ&Aセッションや製品展示も予定しています。ぜひお誘い合わせの上ご参加ください。
定員に限りがございますので、お早めにご登録ください。
ご講演予定の先生 (現時点)
白石 友一 先生，国立がん研究センター
関 真秀 先生，東京大学 新領域創成科学研究科
竹内 一博 先生，京都大学 医学研究科
白澤 健太 先生，かずさDNA研究所
鍋島 圭 先生，国立環境研究所
講演要旨
ロングリードシークエンスは、ショートリードがマッピング困難な領域のDNAメチル化解析や、変異・多型とのメチル化の関連解析などに非常に有効である。また、DNAメチル化解析では制御領域などの限られた領域を高深度で解析することが重要である。しかし、領域特異的なロングリードメチル化解析には、大量のDNAを要する。そこで、微量DNAから実施可能な酵素による塩基変換を利用したロングリードメチル化解析手法nanoEMをハイブリキャプチャー法に適用することで、標的領域を高深度で解析可能なtargeted nanoEM (t-nanoEM)法を開発した。t-nanoEMは最少8 ngのDNAから実施でき、500X以上のカバレッジでの解析が可能であった。ロングリードの性質を活かして、アレルごとのメチル化状態を検出するためのパイプラインを構築した。さらに、がん組織切片から切り抜いた微小サンプルに適用し、がん進展に伴うメチル化状態の変化を検出した。
ロングリードシークエンスは、ショートリードがマッピング困難な領域のDNAメチル化解析や、変異・多型とのメチル化の関連解析などに非常に有効である。また、DNAメチル化解析では制御領域などの限られた領域を高深度で解析することが重要である。しかし、領域特異的なロングリードメチル化解析には、大量のDNAを要する。そこで、微量DNAから実施可能な酵素による塩基変換を利用したロングリードメチル化解析手法nanoEMをハイブリキャプチャー法に適用することで、標的領域を高深度で解析可能なtargeted nanoEM (t-nanoEM)法を開発した。t-nanoEMは最少8 ngのDNAから実施でき、500X以上のカバレッジでの解析が可能であった。ロングリードの性質を活かして、アレルごとのメチル化状態を検出するためのパイプラインを構築した。さらに、がん組織切片から切り抜いた微小サンプルに適用し、がん進展に伴うメチル化状態の変化を検出した。
関 真秀, 東京大学背景：X 连锁遗传疾病通过受性别影响的不同遗传模式影响男性和女性，其中由 X 染色体失活（XCI）引起的差异甲基化会在女性个体引起无症状、轻微和严重的症状等不同表征。通过自适应采样（AS）进行的靶向长读长测序（LRS）在检测X 染色体内的基因组组成和甲基化状态方面表现出了强大的性能，但现阶段并不适用于非高分子量（非-HMW）的DNA。在此，我们优化了一种针对非高分子量 DNA 的靶向 LRS，并验证了其在通过常规方法报告的 X 连锁基因组变异的家族中的诊断效用。 方法：招募了 20 个由先前的染色体微阵列分析和/或低深度二代测序报告 X 连锁遗传缺陷的家庭，并对其进行我们优化的靶向 LRS 测序。检测并分类基因组变异，并进行单倍型分析以评估等位基因特异性甲基化变化。 结果：通过优化基于 AS 的 DNA 片段选择方法（包括尺寸选择、文库构建和测序），我们的靶向 LRS 检测方法在针对目标序列与非目标序列的比对中至少实现了 15 倍的富集倍数，优于基于 AS 的标准方法（8.1 倍）。此外，我们优化后的靶向 LRS 检测方法检测到了先前报道的所有 X 染色体变异，同时通过全面报告具有断点解析的结构变异以及每个基因的甲基化状态，在 7/20 个家庭中发现了新的发现（35%），并导致 3/20 个病例（15%）的变异分类重新评估。 结论：我们的研究展示了针对非高分子量 DNA 的基于 AS 的优化方案，能够全面检测基因组变异和甲基化变化，突显了其在 X 染色体遗传缺陷的基因组诊断中的稳健性能，具有巨大的潜在应用到其他疾病中的潜力。
背景：X 连锁遗传疾病通过受性别影响的不同遗传模式影响男性和女性，其中由 X 染色体失活（XCI）引起的差异甲基化会在女性个体引起无症状、轻微和严重的症状等不同表征。通过自适应采样（AS）进行的靶向长读长测序（LRS）在检测X 染色体内的基因组组成和甲基化状态方面表现出了强大的性能，但现阶段并不适用于非高分子量（非-HMW）的DNA。在此，我们优化了一种针对非高分子量 DNA 的靶向 LRS，并验证了其在通过常规方法报告的 X 连锁基因组变异的家族中的诊断效用。 方法：招募了 20 个由先前的染色体微阵列分析和/或低深度二代测序报告 X 连锁遗传缺陷的家庭，并对其进行我们优化的靶向 LRS 测序。检测并分类基因组变异，并进行单倍型分析以评估等位基因特异性甲基化变化。 结果：通过优化基于 AS 的 DNA 片段选择方法（包括尺寸选择、文库构建和测序），我们的靶向 LRS 检测方法在针对目标序列与非目标序列的比对中至少实现了 15 倍的富集倍数，优于基于 AS 的标准方法（8.1 倍）。此外，我们优化后的靶向 LRS 检测方法检测到了先前报道的所有 X 染色体变异，同时通过全面报告具有断点解析的结构变异以及每个基因的甲基化状态，在 7/20 个家庭中发现了新的发现（35%），并导致 3/20 个病例（15%）的变异分类重新评估。 结论：我们的研究展示了针对非高分子量 DNA 的基于 AS 的优化方案，能够全面检测基因组变异和甲基化变化，突显了其在 X 染色体遗传缺陷的基因组诊断中的稳健性能，具有巨大的潜在应用到其他疾病中的潜力。
董 梓瑞, 香港中文大学长读长全基因组测序对于基因组结构的变异带来了本质的提升，我们使用长读长全基因组测序对遗传病队列进行了测序分析，获得了一系列额外诊断。
长读长全基因组测序对于基因组结构的变异带来了本质的提升，我们使用长读长全基因组测序对遗传病队列进行了测序分析，获得了一系列额外诊断。
赵 森, 北京协和医院
