WYMM Tour: Tokyo

ロングリードシークエンス技術によるRNA解析は、全長転写産物、修飾核酸、スプライシング制御、融合遺伝子、ウイルス転写産物などを直接検出し、がんや慢性感染症における複雑な転写制御を捉える技術である。私たちはレトロウイルス感染症や悪性リンパ腫を対象に統合オミクス解析を進め、多段階発がんに関わる転写異常や創薬標的を同定し、EZH1/2阻害薬の開発や疾患リスク評価へと展開してきた。本講演では、臨床検体を用いたNanopore direct RNA sequencingの実装例を紹介し、病態解明、精密診断、創薬への展望を示す。

エクソームシーケンシングによる希少疾患の診断率は、対象疾患や症例選択基準によって異なるものの、約8～50%に達することが報告されている。さらに、ショートリード全ゲノムシーケンシング、最新の知見に基づく再解析、RNAシーケンシングとの組み合わせにより、診断率を向上させることが可能である。しかし、それでもなお相当数の患者で遺伝学的原因は未解明のままであり、従来の解析では検出が困難な病的バリアントが存在することが示唆される。ロングリードシーケンシングは、ショートリード技術と比較して、構造バリアントやリピート伸長など特定のタイプのバリアントの検出、反復配列やGCリッチ領域など解析困難なゲノム領域の解析、リードに基づくバリアントのフェージング、さらに追加実験を必要とせずDNAメチル化と遺伝的バリアントを同時に解析できることなど、複数の利点を有する。実際にこれまでの研究から、ロングリードシーケンシングによって従来見逃されていた遺伝的バリアントを同定できることが示されている一方、希少疾患診断におけるその有用性については、いまだ十分なコンセンサスが得られていない。本セッションでは、ロングリードシーケンシングを用いた疾患関連構造バリアント検出の経験を紹介するとともに、希少疾患コホートの解析から得られた知見について議論する。

ショートリードを用いたターゲットシーケンスでは、構造異常やコピー数異常（SV/CNV）の検出が困難な場合があり、解析結果を得るまでに長い時間を要することがある。本研究では、全国規模の前向き観察研究であるJCCG-WGS研究において、小児血液悪性腫瘍に対する迅速なゲノムプロファイリング手法として、ターゲットアダプティブサンプリング・ロングリードシーケンス（TAS-LRS）の有用性を前向きに評価した。 日本小児がん研究グループ（JCCG）の参加施設から血液悪性腫瘍患者を登録した。ナノポアシーケンスを用いて、血液悪性腫瘍関連遺伝子およびその周辺領域を標的としたTAS-LRSを実施した。解析パイプラインにより、一塩基変異・短い挿入欠失などの小規模変異、SV、CNV、およびDNAメチル化に基づく分類を実施した。 TAS-LRSにより、短期間で臨床的意義のあるゲノム情報を得ることができた。既知の融合遺伝子に加え、IGH::MYC、IGH::CEBPA、TLX3::BCL11Bなど、エンハンサーハイジャックを引き起こすと考えられる非コード領域の複雑な構造異常を同定した。また、iAMP21や近半数体（near-haploidy）など、疾患サブタイプの決定に重要なCNVも検出できた。DNAメチル化に基づく分類も、評価可能な症例の相当数においてゲノム異常に基づくサブタイプ分類を支持する結果となった。 本研究により、前向き多施設共同研究において、TAS-LRSを用いた迅速かつ包括的なゲノムプロファイリングの実施可能性が示された。本手法は、小児造血器腫瘍における病態の理解を深め、さらには治療方針の決定にも活用できる可能性がある。

がんゲノムの体細胞変異解析において，matched normalから個体自身の2倍体ゲノムを構築し，これを参照として腫瘍の変異を同定するpersonalized reference-based approachが注目されており，セントロメアなどの難読領域の変異検出精度を改善することが報告されている．しかし，染色体スケールでのハプロタイプ分離アセンブリの構築には，複数のロングリードデータに加えHi-C等の位相情報の取得が必要であり，そのコストは臨床応用における障壁となっている．臨床で取得可能なデータから，従来のreference genome上の解析をどこまで上回れるか，またそのために何が必要かは，未解決の問題である．我々は，がんで高頻度にみられるコピー数異常が生むアレル不均衡を利用し，正常組織におけるphase blockを補正・連結して染色体スケールまでphasingを拡張するソフトウェアであるScarpiaを開発した．このハプロタイプ情報をアセンブリに用いることで，Hi-C等の追加実験なしに，スイッチエラーを大幅に抑えたハプロタイプ分離アセンブリが得られる．すなわち，腫瘍・正常ペアのロングリードシーケンスという単一のデータから，ハプロタイプを考慮したSNV，SV解析が可能となる．本講演では，Scarpiaの原理と性能を紹介し，その応用として，コピー数獲得のタイミングをハプロタイプ別に推定する新たな手法を示す．

ヒトの遺伝的多様性を単一の線形リファレンスゲノムのみで十分に表現することには限界があり、特に複雑ゲノム領域ではその影響が顕著である。Japan Pangenome Projectでは、ロングリードシーケンスおよびTelomere-to-Telomere（T2T）ゲノムアセンブリを活用し、日本人集団におけるゲノム多様性をより包括的に捉えるためのパンゲノムリソースの構築を進めている。これにより、従来のショートリード解析では十分に評価することが困難であった領域を解読し、これまで見過ごされてきた配列、構造多型、高度に多型的な遺伝子座の実態を明らかにすることが可能となる。 本講演では、高品質な日本人パンゲノムリソースの構築と、それを集団規模のT2Tゲノム解析へと発展させる現在の取り組みについて紹介する。また、Oxford Nanopore Technologiesを含むロングリードシーケンスが、従来のリファレンスゲノムを前提とした解析の限界をどのように克服し、複雑なゲノム多様性の解明に貢献し得るかについて述べる。 さらに、パンゲノムおよびT2Tゲノム解析の臨床ゲノミクスへの応用可能性について議論する。集団特異的なパンゲノムリファレンスと大規模な疾患ゲノムデータを統合することで、医学的に重要でありながら解析が困難であった領域におけるバリアント検出および解釈の精度向上が期待される。こうした技術基盤を、より包括的なゲノム診断と将来の精密医療へとつなげることが本研究の目標である。

自閉スペクトラム症や統合失調症は、高い遺伝率を示すことが知られており、ショートリードやアレイ解析による疾患に関連したリスクバリアントの同定が進められてきた。しかし、大部分の患者では、病因となるバリアントが同定されていない。その一因として、これらの手法では検出が困難なタンデムリピート伸長や中規模の構造バリアントなどの寄与が考えられる。 発表者らは、精神疾患患者を含む240家系、合計735検体について、PromethIONを用いた全ゲノム解析を実施し、遺伝性及びde novoのバリアントの検出を行った。ナノポアシークエンスを活用することで、構造バリアントやタンデムリピート伸長を含む、疾患との関連が示唆されるバリアントを取得することができた。また、発表者らが開発した精神疾患を始めとした様々な疾患の凍結血液検体に適用可能なウルトラロングリードシークエンス法や分解度の高いRNAでも実施できる完全長cDNA解析法などについても紹介する。