Virtual Nanopore Day, Japan

10月27日(水)－28日(木)、オンラインによるNanopore Day Japan 2021 を開催いたします。

本会では、オックスフォード ナノポアの最新テクノロジーの紹介に加え、ナノポアシークエンスを活用中の先生方から研究への応用例を日本語にてご講演いただく予定です。実際に弊社シークエンサーを活用されている研究者の方々へ直接ご質問いただく時間も設定しておりますので、是非ご参加をご検討ください。

微生物、ヒト、非モデル生物のセッションはそれぞれ独立した形となり、一部のみ参加も可能です。
本セミナーの参加費用は無料です。

本会に関してご質問等は、events@nanoporetech.com にお問い合わせください。

皆様のご参加を心よりお待ちしております。

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10月27日(水)    微生物に関するセッション  (敬称略)

演者: 国立感染症研究所　薬剤耐性研究センター　主任研究官　鈴木仁人
演題：ナノポアシークエンスを用いた薬剤耐性菌のゲノム疫学研究
講演要旨：近年、薬剤耐性菌による難治性感染症が世界の公衆衛生上の問題となっており、特に治療が困難な腸球菌、黄色ブドウ球菌、肺炎桿菌、アシネトバクター属菌、緑膿菌、エンテロバクター属菌などはESKAPE病原細菌と称されている。これらの細菌では日和見感染症の起因菌ながら世界中に拡散している流行株が存在し、しばしば伝達性プラスミドなどの動く遺伝子によって、薬剤耐性や病原性に関わる遺伝子をゲノム上に集積させている。本演題では、薬剤耐性病原細菌のゲノム疫学解析に役立つデータベースや解析ツールをご紹介するとともに、国内外のヒト、家畜、環境から分離されたESKAPE病原細菌を含む薬剤耐性細菌株のゲノム疫学解析およびメタゲノム解析について我々の試みをご紹介したい。

演者: 東京大学大学院　工学系研究科化学生命工学　教授　鈴木勉
演題：Direct nanopore sequencingによるtRNAの単分子解析
講演要旨：RNAは転写後に様々な修飾を受ける。タンパク質合成におけるアダプター分子であるtRNAは、最も複雑に修飾されたRNA分子であり、これまでに見つかっている約150種類のRNA修飾のうち、約8割がtRNAから発見されたものである。tRNAの修飾の生理的重要性は、tRNAの修飾欠損によってヒトの疾患が生じることから窺い知ることができる。各tRNAの定常状態量や修飾率は、細胞が置かれた環境やストレスに応じて、時空間的にダイナミックに変動することが知られている。タンパク質合成において、コドンごとの適切な翻訳速度は、mRNAの安定性や正しいタンパク質のフォールディングを決定する主要な因子であることが知られており、tRNAの発現量や修飾状態は、翻訳速度に直接的に影響を与え、遺伝子発現を変動する大きな要因になっている。
tRNAの更なる生理的意義を探求するためには、各tRNAの発現量及び修飾レベルを定量的かつ網羅的に測定する技術の開発が求められている。現状で用いられている手法は、いずれもtRNAを逆転写によりcDNA化してシーケンス解析をするため、大部分のRNA修飾の情報はcDNA化の過程で消去され、検出可能な修飾の種類が限定的である、という根本的な問題がある。ナノポアシーケンサーは、RNAをcDNA変換せずに直接配列解析することが可能な唯一の1分子シーケンサーであり、RNA修飾の情報を含んだシグナルを得ることが可能である。しかし既存の情報解析ツールではRNA修飾の情報を読み取ることができない。私たちは、ONT社のナノポアシーケンサーを用いて細胞から抽出したtRNAを直接解析し、得られたシグナルを機械学習によって解析し、tRNAの種類と修飾状態を特定する技術の開発を行っている。今回私たちは、大腸菌で発現する全44種類のtRNAを単離精製し、各tRNAに対して共通のアダプターを連結し、ナノポアシーケンスを行った。全tRNA種の電流値の波形データを用い、畳み込みニューラルネットワークに深層学習させた。様々な学習モデルの適用及び各種パラメーターの調節を行った結果、全44種類のtRNAを平均で98%の精度で分類する“分類器”の構築に成功した。この分類器を用いてtotal tRNAの分類を行い、異なる株間や異なる培養条件下での発現量の変動を解析することに成功した。さらに、特定のtRNA修飾が欠損しているtRNAをナノポアシーケンスし、深層学習することにより、たった一か所のtRNA修飾の有無を判別し、修飾率を定量する“検出器”の作成に成功した。

 

演者: 東京大学先端科学技術研究センター　生命データサイエンス分野　特任講師　上田宏生
演題：nanoDoc を用いたRNA修飾の検出
講演要旨：近年のナノポアシーケンスの発展により、RNA修飾を直接とらえ修飾の解析をすることが可能になりつつある。
RNA修飾は電流値の乱れとして検出されるが、正確な検出の為には新たな手法の開発が必要である。
そこで、 Deep One Classと呼ばれる深層学習の1クラス分類法を用いた、RNA修飾検出手法「nanoDoc」を開発している。
この手法で大腸菌と出芽酵母のリボソームRNAデータセットを使用して23種類のRNA修飾を検出し、AUC0.96 の精度を達成した。
さらに、教師なしクラスタリングを使用し、異なる種類のRNA修飾が分類可能なことを示した。
nanoDocは、https：//github.com/uedaLabR/nanoDocで入手できるオープンソースソフトウェア（GPLv3）である。
講演では、nanoDocの概要とトランスクリプトームワイドなRNA修飾検出の課題について議論する。

 

演者: 公益財団法人結核予防会 結核研究所　生体防御部　部長　土方美奈子
演題：ベトナム中部における結核菌 lineage 1 サブグループの遺伝子型の特徴
講演要旨：結核は、Mycobacterium tuberculosis（Mtb）によって引き起こされる感染症であり、世界的に大きな健康上の脅威の一つとなっている。世界保健機関（WHO）によると、年間1,000万人の新規結核患者発生と120万人の結核死亡者が推計されている。ゲノム解析から、人類は約7万年前から結核と共存しているとされ、人類とMtbの共進化が指摘されている。様々な分子型別法や全ゲノム配列解析（WGS）により、MtbにはL1からL7と呼ばれる7つの遺伝系統があり、Mtbの遺伝子型の割合は地域により集団間で異なることが明らかになっている。我々は、ベトナム中部のダナンで、塗抹陽性の肺結核患者から181株のMtbを収集した。WGSを用いて、それらのゲノムの特徴を調べたところ、より古い遺伝系統に属するベトナム固有のL1株は若年層からの分離が少なく、他のより新しい遺伝系統の株に比べて遺伝的なクラスターの割合が少ないことがわかった。また、Nanopore社のロングリードシークエンシングデータを用いたゲノムアセンブリにより、それらの構造変異を解析した。より古い遺伝系統に属するL1株のゲノムの特徴の解析は、より新しい遺伝系統のMtb株との対比を通じて、遺伝系統により多様な性質を有する結核菌に対する効果的な対策の検討につながると考えられる。

 

10月27日(水)    ヒトゲノムに関するセッション  (敬称略)

演者: 東京大学大学院　新領域創成科学研究科　教授　鈴木穣
演題：最新型Q20キットと PromethIONを活用したがんゲノムの長鎖シークエンス解析
講演要旨：本セミナーでは、PromethIONを用いたがんゲノムの長鎖シークエンス解析、特にその最新プラットフォーム「Q20キット」の活用例について、演者らの最近の試行にして紹介したい。 演者らはPromethIONを用いたゲノムのフェージング解析を試みた。がんゲノム突然変異が存在する染色体背景は、それのメカニズムと発生順序を理解するために貴重な情報を提供する。しかし、一般に従来の短鎖シークエンス解析では、その遺伝子座/ハプロタイプを解析することは依然として困難である。今回、我々た日本人患者から得られた合計20の非小細胞肺癌検体について、癌ゲノムのPromethION分析を実施した。平均N50ブロック長834 kbのフェージング情報が得られ、それぞれのブロックには平均180万のヘテロSNPを含んでいた。正常/腫瘍ペア間の比較、またはショートリードシーケンスデータに基づいて構築された外部の日本人コホートとの比較から得られたフェージングのエラーは1％以下であると見積もられた、フェージングされたゲノムに対して、一塩基多型（SNV）から大きな構造変異（SV）までの癌突然変異をマッピングした。EGFR、p16等の典型的がん関連遺伝子の変異について染色体背景を明らかにすることができた。さらに、これらのゲノム変異と、PromethIONデータからCallされたDNAメチル化やトランスクリプトームパターンなどの他のオミクス機能との統合解析を行った結果、それぞれの対立アリルが必ずしも等価でない領域が同定された。

 

演者: 東京大学大学院　医学系研究科国際保健学専攻人類遺伝学教室　清瀬大樹
演題：ロングリードシーケンシング技術を用いた肝癌の完全長のトランスクリプトーム解析
講演要旨：遺伝子は、スプライシングによってさまざまな転写産物を生成し、これらの転写産物は多様な機能を持つ。しかし、多くのトランスクリプトーム解析では、ショートリードシーケンシング技術（次世代シーケンサー）が用いられており、完全長の転写産物を直接読み取ることはできなかった。ロンングリードシークエンス技術を用いれば、完全長の転写産物を読み取ることができるが、エラー率の高さ等からデータの解析は困難であった。本研究では、完全長cDNA配列を解析するために、SPLICEという解析パイプラインを開発した。この方法を用いて、42組の肝細胞癌(HCC)の癌部および対象非癌部のcDNA配列をナノポアシークエンサーで解析した。解析の結果、癌部と非癌部では、タンパク質をコードする遺伝子から46,663個の転写産物が検出され、そのうち5,366個（11.5％）が新規であった。癌部と非癌部で発現量レベルを比較すると、9,933転写産物(4,744遺伝子)が有意に発現変化しており、そのうち746個の遺伝子は遺伝子レベルの解析では有意な発現差は見つからなかった。また、転移因子と癌関連遺伝子（MET、HBxなど）のキメラがHCCで過剰発現しており、細胞増殖を促進する可能性があることもわかった。さらに、融合遺伝子の検出では、ショートリードでは検出されなかった新規の融合遺伝子が検出された。これらの結果は、完全長トランスクリプトーム解析の有用性と、発がんにおけるスプライシングバリアントの重要性を示唆するものである。

演者: 信州大学医学部　人口聴覚気学講座　特任講師　西尾信哉
演題：ヒト難聴遺伝子解析の進展とNanoporeを用いた解析
講演要旨：先天性難聴は、新出生児1000人に1〜2人に認められる比較的頻度の高い疾患である。疫学調査によると、先天性難聴あるいは小児期発症の難聴の原因のうち60〜70%に遺伝子が関与することが推測されており、原因として最も頻度が高いのが遺伝性難聴である。遺伝学的検査を行い難聴の原因を明らかにすることで、難聴のタイプや重症度、予後の予測、随伴症状の予測など難聴の個別化医療の実現に欠かすことできない有用な情、報が得られる。
我々の研究室では、「難聴の遺伝子解析研究」に取り組んでおり、すでに日本全国のネットワークを通じで解析を実施した12000例を超える症例のNGS解析を行い、見出された遺伝子変異情報と臨床情報を統合管理するデータベースに管理している。公演では難聴の遺伝子解析の進展、保険診療で実施しているNGSプラットフォームでのCNV検出など最新の知見を紹介するとともに、Oxford Nanoporeシークエンサーを用いた研究と今後の展望について紹介する予定である。

 

10月28日(木)    非モデル生物に関するセッション  (敬称略)

演者: 農研機構　遺伝資源研究センター　上級研究員　内藤健
演題：PromethIONと植物ゲノム
講演要旨：アズキの研究者として認知されつつある私ですが、理由あってキュウリ・メロン・ナスをそれぞれ100品種ずつゲノムを決めるというプロジェクトを担当することになりました。お陰様でPromethIONを導入する運びとなり、楽しく使っております。講演において私に期待されているのは植物ゲノムのアセンブルに関することだと思いますので、今回もそのお話をしようと思います。実験医学から出版されたプロトコル集には間に合わなかった改良版をお送り致します。

 

演者: 東京海洋大学大学院　ゲノム科学研究室　川戸智
演題：クルマエビのドラフトゲノム
講演要旨：エビやカニなどに代表される十脚甲殻類 (decapod crustaceans) のゲノム解析は、昆虫など他の節足動物に比べ立ち遅れてきた。これは、ゲノムサイズが大きいこと（数Gb）や、反復配列が多くショートリードによる解析が困難であったことが要因と考えられる。我々は、水産上の重要種であるクルマエビ (Marsupenaeus japonicus) のドラフトゲノムを構築するため、ナノポアシーケンシングを行った。
クルマエビ冷凍筋肉からフェノール/クロロホルム法で粗抽出したDNAをNucleoBond AXG Columnで精製した。ライゲーションキット (SQK-LSK109) で作製したライブラリをR9.4.1フローセルでシーケンシングし、計14.6 Gbのリードを得た (2.48 million reads; N50: 12.5 kbp) 。
ショートリードで構築したドラフトゲノムのスキャフォールディングとギャップフィルにナノポアリードを活用し、推定ゲノムサイズ (1.93 Gb) の88%にあたる1.7 Gb分のドラフトゲノム (18,120 scaffolds; scaffold N50: 235 kbp; BUSCO completeness: 94.1%) を得た。ドラフトゲノムの27％を単純反復配列 (simple sequence repeats) が占めていた。これらの反復配列に起因するギャップを閉じるうえでナノポアリードは極めて有用であった。
現在直面している課題として、甲殻類から抽出したゲノムDNAはポアを詰まらせやすい点が挙げられる。今後、サンプリングに最適な組織の選択やDNA抽出法の改善など、一連の工程を見直すことで収量とリード長を改善し、ナノポアリードベースのde novoアセンブリを実現していきたい。

 

演者: 慶應義塾大学　先端生命科学研究所　准教授　荒川和晴
演題：オモロイ生物のゲノム解析：クマムシとミドリムシを例に
講演要旨：ダーウィン的進化の骨頂は「例外」を創り出すことにあり、一般的な枠組みから外れた「オモロイ」生物の解析にこそ生物学の醍醐味がある。ここでは、何をしても死なない地上最強生物であるクマムシと、動物なのに光合成できるミドリムシを例にそのゲノム解析について紹介する。ただし、これらオモロイ生物の解析は一筋縄ではいかない。クマムシは体長0.3mm程度の微小な動物であり、飼育可能な種が限られることから、野外採取種１個体からとれるわずか50pg程度のゲノムDNAを元に解析を行う必要がある。ミドリムシは、ATGCの4塩基に加え、第五のBase Jを持ち、さらに遺伝子構造が他の生物と異なり、既存の遺伝子予測ソフトウェアが通用しない。そこで、クマムシにおいてはDroplet-MDAを用いた超微量ナノポアシークエンス法を、ミドリムシにおいてはBase Jのコールを含めたナノポアシークエンス解析と古くて新しいバイオインフォマティクスパイプラインによってこれに挑んでいる。
 

Virtual Nanopore Day, Japan

We are delighted to announce that we are holding a Virtual Nanopore Day, Japan on 27th and 28th October 2021.

Hear about the latest tech updates for Oxford Nanopore Technologies as well as talks from local scientists in Japan about their latest work using nanopore technology. There will be an opportunity to ask each of the speaker questions in the live Q&A session following their talk.

Confirmed speakers include:

•    Masato Suzuki, National Institute of Infectious Diseases
•    Tsutomu Suzuki, University of Tokyo
•    Hiroki Ueda, University of Tokyo
•    Minako Hijikata, The Research institute of Tuberculosis, Japan Anti-Tuberculosis Association
•    Yutaka Suzuki, University of Tokyo
•    Hiroki Kiyose, University of Tokyo
•    Shinya Nishio, Shinshu University School of Medicine
•    Ken Naito, National Agriculture and Food Research Organization
•    Satoshi Kawato, Tokyo University of Marine Science and Technology
•    Kazuharu Arakawa, Keio University

There is no delegate fee for this event. Please note that all presentations will be given in Japanese.

Looking forward to seeing you at Virtual Nanopore Day, Japan!

 

Microbiology Session  -  Wednesday, 27th October

Presenter: Masato Suzuki, National Institute of Infectious Diseases
Title: Genomic epidemiological analysis of antimicrobial-resistant bacteria
with nanopore sequencing

Abstract: Recently, opportunistic infections caused by antimicrobial resistant bacteria, such as ESKAPE pathogens (Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumanni, Pseudomonas aeruginosa, and Enterobacter spp.) have become a global public health threat. These bacteria have generated epidemic clones that spread around the world and often accumulate important acquired genes related to antimicrobial resistance and virulence in their genomes by mobile gene elements, such as plasmids. In this talk, we would like to introduce databases and analysis tools that are useful for the genomic epidemiological analysis of antimicrobial resistant pathogenic bacteria, as well as our studies on the genomic epidemiological and metagenomic analysis of antimicrobial resistant bacteria, including ESKAPE pathogens, isolated from humans, animals, and the environment in Japan and other countries.

Presenter: Tsutomu Suzuki, University of Tokyo
Title: Single molecule analysis and profiling of tRNAs by direct nanopore sequencing

Abstract: Transfer (t) RNAs are extensively decorated with a wide variety of post-translational modifications. The physiological importance of tRNA modification has been demonstrated by human diseases caused by aberrant tRNA modification. Although tRNAs are ubiquitously expressed, steady-state level of each tRNA is dynamically regulated in different cells and tissues in spatiotemporal manner. It is also known that frequency of tRNA modification can be altered in response to various cellular environment and stresses. Alteration of tRNA abundance and its modification status modulate optimal translation, affecting mRNA stability and/or proper protein folding.
To explore physiological importance of tRNAs in various biological contexts, it is necessary to establish an innovative technology to profile and analyze cellular tRNAs with their modification status. Although NGS-based methods are highly sensitive and suitable for profiling tRNAs and detecting several tRNA modifications from limited specimens, they are applied only for specific tRNA modifications, because most of the information about RNA modifications is eliminated during cDNA conversion. Nanopore-based sequencing is a unique method capable of directly analyzing RNA molecules without cDNA conversion. A characteristic ion current signal is observed when a modified RNA residue passes through the nanopore. We aim to establish a handy and practical method for classifying cellular tRNAs with their modification status using a nanopore sequencer provided by Oxford Nanopore Technologies. We isolated all 44 species of E. coli tRNAs and nanopore-sequenced each of them individually. All tRNA datasets were used for deep learning using a convolutional neural network (CNN). After examining various learning models and increasing the number of epochs, we succeeded in raising the classification accuracy to a practical level (>98% on average). We are going to show performance of our tRNA classifier on profiling E. coli crude tRNA fraction from various sources.

Presenter: Hiroki Ueda, University of Tokyo
Title: RNA modification detection using nanoDoc

Abstract: Advances in Nanopore single-molecule direct RNA sequencing (DRS) have presented the possibility  of detecting comprehensive post-transcriptional modifications (PTMs) as an alternative to experimental  approaches combined with high-throughput sequencing. It has been shown that the DRS method can detect  the change in the raw electric current signal of a PTM; however, the accuracy and reliability still require  improvement. Here, I present a new software program, named as nanoDoc, for detecting PTMs from DRS  data using a deep neural network. Current signal deviations caused by PTMs are analyzed via Deep One Class Classification with a convolutional neural network. Using a ribosomal RNA dataset, the software  archives displayed an area under the curve (AUC) accuracy of 0.96 for detecting 23 different types of  modifications in Escherichia coli and Saccharomyces cerevisiae. Furthermore, I demonstrated a tentative  classification of PTMs using unsupervised clustering. Finally, I applied this software to severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 data and identified commonly modified sites among three groups.  nanoDoc is an open source software (GPLv3) available at https://github.com/uedaLabR/nanoDoc

Presenter: Minako Hijikata, The Research institute of Tuberculosis, Japan Anti-Tuberculosis Association
Title: Genotypic features of the Mycobacterium tuberculosis lineage 1 subgroup in central Vietnam

Abstract: Tuberculosis (TB) is an infectious disease caused by Mycobacterium tuberculosis (Mtb) and is one of the major global health threats. The World Health Organization estimates that there are 10 million new TB cases and 1.2 million TB deaths per year. Genomic analysis indicated that human has been living with TB for roughly 70,000 years, and Mtb has been coevolving with human. Various molecular typing methods and whole genome sequencing (WGS) have revealed that there are seven lineages of Mtb, referred to as L1 to L7, and Mtb genotypes vary among populations depending on different geographic areas. We collected 181 Mtb strains from patients with smear-positive pulmonary TB in Da Nang, central Vietnam. Using WGS, their genomic characteristics and phenotypes were studied to find that ancestral Vietnamese L1 strains were isolated less often from younger people and they were genetically clustered less frequently than other modern strains. Their structural variants were also analyzed by genome assembly with Nanopore long-read-sequencing data. Distinctive genomic features of the ancestral L1 strains provide a basis for investigation of the modern versus ancestral Mtb lineages and allow consideration of countermeasures against this heterogeneous pathogen.

Human Genome Session  -  Wednesday, 27th October 

Presenter: Yutaka Suzuki, University of Tokyo
Title: Long read sequencing analysis of cancer genomes; the trial use of the latest platform of PromethION Q20 kit

Abstract: In this seminar, the application of PromethION, especially the latest platform of “Q20 kit” for the whole cancer genome sequencing analysis, will be demonstrated. As the first use of the Q20 kit, we attempted the phasing analysis of lung cancer genomes. Chromosomal backgrounds in which cancerous mutations are resided upon could provide invaluable information for our understanding of their mechanism(s) and order of occurrence. However, it remains still elusive in which alleles/haplotypes, the cancerous mutations, either the single nucleotide variations (SNVs) or structural variations (SVs) are resided. We conducted a PromethION analysis for a total of 20 non-small cell lung cancer specimens obtained by Japanese patients. The latest Q20 kit was also utilized. An average N50 block length of 834 kb was obtained, each of which harbors 1.8 million heterozygous single nucleotide polymorphisms (SNPs). One percent of the phasing errors were detected as a result of the comparison between normal/tumor pairs or the comparison with the phase information provided by an external Japanese cohort that was constructed based on short-read sequence data. The phased cancerous somatic mutations, ranging from single nucleotide variants (SNVs) to large structural variants (SVs), were further interrogated regarding their biological relevance. We further assessed the relationship between genomic mutations and other omics features such as DNA methylation and transcriptome patterns. We will demonstrate the possible cancerous events, which have not been identified by hitherto short read platforms, should be firstly revealed by the intensive use of the long read sequencing technology.

Presenter: Hiroki Kiyose, University of Tokyo
Title: Full-length transcriptome analysis of liver cancer using a long-read sequencing technology.

Abstract: Genes generate various transcripts by alternative splicing, and these transcripts can have diverse functions. However, in most transcriptome studies, short-reads sequencing technologies (next-generation sequencers) have been used and full-length transcripts have not been observed directly. Although long-reads sequencing technologies would enable us to sequence full-length transcripts, analysis of the data is a difficult task. In the present study, we developed an analysis pipeline named SPLICE to analyze full-length cDNA sequences. Using this method, we analyzed cDNA sequences from 42 pairs of hepatocellular carcinoma (HCC) and matched non-cancerous liver with Oxford Nanopore technology. Our analysis detected 46,663 transcripts from the protein-coding genes in the HCCs and the matched non-cancerous livers, of which 5,366 (11.5 %) were novel. Comparison of expression levels identified 9,933 differentially expressed transcripts in 4,744 genes, of which 746 genes were not found by the gene-level analysis. We also found that chimeras of transposable elements and cancer-related genes (MET, HBx, etc.) were overexpressed in HCCs, and that they could promote cell proliferation. Furthermore, fusion gene detection showed novel recurrent fusion events, which have not been detected short-reads. These results suggest the efficiency of analysis of full-length transcriptome studies and the importance of splicing variants in carcinogenesis.

Presenter: Shinya Nishio, Shinshu University School of Medicine
Title: Recent progresses in genetic analysis and nanopore sequencing in hereditary hearing loss

Abstract: Congenital hearing loss is one of the most common sensory disorders, occurring in one of 700–1,000 newborns. Approximately 50–70% of cases are attributable to genetic causes. More than 120 genes have been identified as a cause of hearing loss (Hereditary Hearing Homepage; http://webh01.ua.ac.be/hhh/).Recent advances in next-generation sequencing have given rise to new challenges due to difficulties in variant pathogenicity interpretation and large dataset management, including many kinds of public population databases as well as public or commercial disease-specific databases. We developed a database software for improving clinical next-generation sequencing workflow through the unified management of variant information and clinical information. Based on this database software, we developed a central database system to manage the over 12,000 of target re-sequencing analysis results and clinical information associated with the Japanese nation-wide deafness gene study consortium. This database is a powerful tool for genetic testing especially for the variant pathogenicity classification based on large number of patients data. We will also present the newly developed copy number analysis tool for social health insurance based genetic testing platform. We also present recent study by using Oxford Nanopore sequencer and discuss the future directions.

Plant & Animal Session -  Thursday, 28h October

Presenter: Ken Naito, Research Center of Genetic Resources, National Agriculture and Food Research Organization
Title: Tricks to assemble your plant genome

Abstract: Plant genomes are often tricky and are not easy to sequence or assemble. So I'm going to talk about some tricks of our library prep and assembly protocols. I'll also introduce our project for sequencing plant genetic resources in our Genebank with a PromethION 24.

Presenter: Satoshi Kawato, Tokyo University of Marine Science and Technology
Title: Draft genome assembly of the kuruma shrimp, Marsupenaeus japonicus

Abstract: Despite their economic and ecological importance, the genomics of decapod crustaceans, such as shrimp and crabs, has been lagging behind that of insects and other arthropods. Most decapods have highly repetitive, gigabase-sized genomes, making them difficult to analyze by short-read-based approaches. Here, we share our experience on applying Nanopore sequencing for a draft genome assembly of the kuruma shrimp (Marsupenaeus japonicus).
We extracted genomic DNA from muscle by phenol-chloroform extraction, and the crude DNA was further purified using NucleoBond AXG Columns. Libraries were prepared using the Ligation Sequencing Kit (SQK-LSK109) and sequenced on R9.4.1 flow cells, generating 14.6 Gb (2.48 million reads; N50: 12.5 kbp).
The Nanopore reads were used to iteratively scaffold and gap-fill an initial short-read-based assembly. The final assembly (1.70 Gb; 18,120 scaffolds; scaffold N50: 235 kbp; BUSCO completeness: 94.1%) covered 88% of the estimated genome size (1.93 Gb). Simple sequence repeats occupied 27% of the final assembly; in fact, the Nanopore reads were extremely useful for closing assembly gaps arising from these simple repeats, which could not be resolved by short reads.
One of the challenges we are currently facing is that crustacean DNA is extremely “cloggy”. We have consistently experienced a rapidly inactivation of sequencing pores when sequencing crustacean samples, although the inactivated pores can be readily revived by a nuclease flush. We envision that improvements in the entire workflow, combined with new generations of chemistry and flow cells, will enable a Nanopore -based de novo assembly of the kuruma shrimp genome.

Presenter: Kazuharu Arakawa, Keio University
Title: Genome analysis of unusual animals: tardigrades and euglena

Abstract: The hallmark of Darwinian evolution is the creation of “exceptions”; therefore, the charm of biology is in the study of these “unusual” organisms. Here, I report the genomics of the extremotolerant tardigrades that can survive exposure to outer space, and the ambivalent euglena which behaves like an animal as well as a plant. Analysis of these organisms, however, also requires exceptional techniques. Tardigrades are often unculturable and microscopic in size, containing a mere 50pg of genomic DNA. Euglena contains not only the four ATGC bases but also a fifth Base J, and its gene structures are highly unusual, hindering the use of existing gene finders. I challenge these extraordinaries using ultra-low input nanopore sequencing with Droplet-MDA for tardigrades, and Base J calling with nanopore reads and an old-school bioinformatics pipeline for euglena.