快速测序RNA病毒基因组

肠道病毒 (EV）是一种单链RNA病毒，每年可造成全球数百万人感染。感染引起的临床表现广泛，可从良性咽喉痛到更为严重的情况，如支气管炎和肺炎¹。基于PCR 的检测是常规鉴定具有临床价值的病毒最常用的方法。然而，在使用基于 PCR 的技术时，病毒基因组中经常出现的点突变和重组事件有可能导致出现假阴性结果。此外，目前的检测技术需要进行病毒培养，这通常需要 5-10 天，大大延迟了拿到结果的时间¹。为了克服这些难题，瑞士伯尔尼大学的 Alban Ramette 博士及其小组评估了使用纳米孔 cDNA 和直接 RNA 测序从临床研究样本中获取完整的肠道病毒基因组序列的能力¹。

使用来自培养的病毒 cDNA 样本，在开始测序运行的几分钟内可以获得 98.8％ 的序列一致性准确度。使用 nanopolish² 工具处理序列，精确度随后能提高到99.8％（图）。

不需要逆转录或扩增的RNA直接测序在时间要求严格的应用中尤为有用，例如病原体鉴定。伯尔尼大学用于 RNA 直接测序的样本制备方法只用 5.5 个小时，而cDNA 方法需要 23 个小时¹。

为了进一步简化该过程，研究人员从粪便样品获取了 RNA 直接测序的样本，并且没有预先行病毒培养。尽管样本制备方法仅产生了140ng 的 RNA，与推荐的 500ng 起始量相差较远，但该小组根据11条读长 (长度通常大于1000个碱基）测序并组装出了完整的柯萨奇病毒 (Coxsackievirus）基因组。此外，研究显示，一条含有7208个碱基的单一读长几乎覆盖了整个基因组（与参照柯萨奇病毒基因组序列相比，仅在序列的5’和3’末端少了 25 和 109 个碱基)。

Alban 对工作进行了总结并评论道：

“cDNA测序提供的灵敏度和 PCR 法相当，而直接 RNA 测序提供了最快的样本到结果周转时间，无需扩增或逆转录偏好性”¹.

本研究案例来源于微生物白皮书。