揭示转基因植物基因组的复杂性

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在使用单张 MinION 测序芯片在短短4天内成功测序并组装了高度连续和精确的拟南芥基因组之后1,克雷格·文特尔研究所(J. Craig Venter Institute)的团队与索尔克研究所 (Salk Institute) 的研究人员将注意力转向了使用长读长纳米孔测序来分析转化后的转基因株系2,3

转基因(GM)植物自1982 年以来就已经存在, 当时研究人员研发出的一种烟草表达出细菌抗生素耐药基因30。从那时起,转基因作就携带一系列有益的性状被进行生产,其中包括增产、 抗除草剂和抗病能力提高,以及产品特性增强,如保质期延长。

通过使用根癌农杆菌 (Agrobacterium tumefaciens)是将新遗传物质导入植物细胞的最常见方法之一。这种植物病原菌可随机将其质粒中包含的 DNA 插入宿主基因组中的双链断裂处。出于科研和监管的原因,表征这种转移DNA (T-DNA) 的插入位点和拷贝数非常重要的。然而,传统的类如 Southern blotting的分析技术,可能相当费劲,且辨识度不足。

为了应对这一挑战,研究团队利用光学图谱和长读长纳米孔测序来检测拟南芥的(A. thaliana)两个转化基因组和一个参考株系。每个株系都在单张 MinION 测序芯片上得以完整测序。组装得到高度连续的基因组,仅一至两个 contig 就覆盖了完整的染色体臂。基因组分析使该团队能够解析长达 36kb 的转移 DNA 结构,并揭示了与大规模转移 DNA 相关的易位和染色体臂端交换。

此外,两个转基因株系 (SAIL_232和 SALK_059379) 的序列 contig 捕获了长达 39kb 的组装的转移 DNA 插入序列,为更好地理解这种农杆菌介导的转基因插入的复杂性 (例如重新排列、插入、 缺失等),以及这些插入对近端基因的影响提供了足够的信息。

纳米孔测序技术可将 T-DNA 结构的分辨率提升至 36 kb长度3

这项研究为了解工程植物基因组的结构影响提供了新的见解,并展示了先进的长片段测序技术可快速鉴定出预期之外的基因组变化方向的效用。该团队现在计划利用纳米孔测序数据来鉴定其转化基因组的甲基化状态,以期有可能取代单独的基于亚硫酸氢盐测序的甲基化分析。Todd Michael 教授在评论这项研究时说道:

“众所周知 [T DNA] 插入的长度多变,且数量多,然而直到长读长 Oxford Nanopore 技术的出现,我们才真正能够看到这些插入片段是什么样的”2

case study figure 1.PNG图:使用 MinION 纳米孔测序能解决短读长拟南芥参考基因组中的组装错误和转化株系中转移DNA的插入位点。(a) TAIR10野生型参考株系的 2 号染色体和纳米孔测序的 Col-0 野生型株系及 SALK_059379 转化株系。两个染色体臂都存在于单个 Col-0 contig 中,并且 TAIR 10 参考组中的错误组装得以纠正。SALK 株系中的蓝色框代表转移 DNA 的插入,这在 (b,d) 光学图谱中很明显。(c,e) 纳米孔测序数据能够完整解析 27,546 bp 的插入和部分解析 206,818 bp 的插入。图片由美国克雷格·文特尔研究所的 Todd Michael 教授提供。

本研究案例来源于植物白皮书。

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References

  1. Michael, T.P. et al. High contiguity Arabidopsis thaliana genome assembly with a single nanopore flow cell. Nat Commun. 9(1):541 (2018).
  2. Michael, T. The complex architecture of plant T-DNA transgene insertions. Presentation. Available at: https://nanoporetech.com/ resource-centre/complex-architecture-plant-t-dna-transgene-insertions [Accessed: 10 July 2018]
  3. Jupe, F. et al. The complex architecture of plant transgene insertions. bioRxiv 282772 (2018).
  4. Fraley, R.T. et al. Expression of bacterial genes in plant cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80 (15): 4803–07 (1983).
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