表征失智症中的串联重复序列

PromethION

串联重复序列(TR)涉及许多疾病,包括亨廷顿氏症、额颞叶型失智(FTD)和肌萎缩侧索硬化症(ALS)。这种重复可以通过其长度、序列或碱基修饰引起疾病,然而,这些特征通常很难,甚至不可能用传统的分析技术进行评估1。另外,现有技术每次仅靶向单个串联重复位点并且周转时间长。直接长读长纳米孔测序能够跨越大的串联重复序列,从而显示其大小、核苷酸组成和碱基修饰的情况。此外,高通量、高产量的PromethION平台技术可大规模使用,从而可以对多个基因组的串联重复序列进行全面分析。

为了评估纳米孔测序可以完全解析串联重复序列,安特卫普大学VIB的研究人员使用PromethION对11个样本进行了全基因组测序1,2。所有样品均获得一致的高产量,单个测序芯片的最大产量为98Gb*(30X的基因组覆盖度)。研究小组重点分析了ABCA7基因中的一个数目可变串联重复序列(VNTR),他们近期发现,这个重复序列导致患阿尔茨海默症的风险至少增加4倍。

所有 ABCA7 VNTR等位基因,包括那些含有高达10000 bp扩增的等位基因,均通过长测序读长覆盖。然而,现有的核苷酸测序比对工具难以准确地解析这些长串联重复序列的长度。为了克服这些挑战,研究小组开发了NanoSatellite3,一种利用原始纳米孔“squiggle”数据的新算法,而非通过碱基识别序列以表征重复序列。该方法可以检测所有临床相关的重复扩增,并展示出与Southern印迹杂交(当前的“黄金标准”分析技术)相当的读长长度估计值(图1)。重要的是,NanoSatellite还成功鉴定了两个VNTR等位基因,而在使用Southern印记杂交技术时,这两个个体显示为纯合子,这强调了该技术的灵敏度有提升。

研究人员强调了PromethION平台的优势,并评价说:

“人类基因组中的许多串联重复序列(其中一些目前尚未表征化)可以通过单次测序运行同时进行研究,并且可以评估不稳定(扩增的)TR体细胞差异,最终将带来新的疾病相关TR的鉴定和诊断的改进”1

图 1: 比较通过NanoSatellite在原始纳米孔信号数据中或串联基因型重复序列识别工具(碱基识别使用Albacore、Scrappie events或Scrappie raw)在核苷酸序列中识别到的串联重复序列长度。在所有情况下,NanoSatellite与Southern印迹杂交(虚线)体现更高的一致性。正链(红色);负链(蓝色)。TG=串联基因型重复序列识别工具。图片改编自De Roeck 等人。1

Gieß elmann等人也证明了使用原始纳米孔信号可以表征短串联重复序列4。采用CRISPR-Cas12a富集方法,研究小组选择性地靶向C9orf72基因中的重复序列(导致额颞叶型失智[FTD]和肌萎缩侧索硬化[ALS])与FMR1基因中的重复序列(涉及脆性X综合征)。内部开发的nanoSTRique分析工具可以精确表征重复长度,而无扩增富集策略进一步实现了表观遗传修饰的分析,表明了两个基因的扩增等位基因在基因启动子CpG岛的甲基化显著增加。

本案例研究来源于临床研究白皮书

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References

1. De Roeck, A. et al. Accurate characterization of expanded tandem repeat length and sequence through whole genome long-read sequencing on PromethION. bioRxiv 439026 (2018).

2. De Roeck, A. Human genome sequencing on PromethION to investigate tandem repeats in dementia. Presentation. Available at: https://nanoporetech.com/resource-centre/human-genome-sequencing-promethion-investigate-tandem-repeats-dementia [Accessed: 30 October 2018]

3. GitHub. NanoSatellite. Available at: https://github.com/arnederoeck/NanoSatellite [Accessed: 31 October 2018]

4. Gießelmann, P. et al. Repeat expansion and methylation state analysis with nanopore sequencing. bioRxiv 480285 (2018).

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